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1、第第四四章酶的提取章酶的提取与分离纯化与分离纯化预处理预处理(pretreatment):):包括固液分离和细胞包括固液分离和细胞 破碎破碎(分离胞内产物分离胞内产物)等等。初步纯化初步纯化(rough(rough fractionatifractionation)on)提取提取):除除去与目的产物性质差异很大的杂质。去与目的产物性质差异很大的杂质。高度纯化高度纯化(fine(fine fractionatiofractionation)n)(精 制):除去与产物性质相似的杂质。去与产物性质相似的杂质。浓缩与干燥浓缩与干燥(concentrationconcentration andand d
2、esiccatidesiccation)on)(成品加工成品加工):):使使酶酶与溶剂分与溶剂分离离的过程。的过程。第五节纯化方案的设计与评价第五节纯化方案的设计与评价一、纯化方案的设计一、纯化方案的设计(一一)纯化方法的选择依据纯化方法的选择依据根据有效成分和杂质之根据有效成分和杂质之间理化性质的差间理化性质的差异异1.1.调节溶解度：调节溶解度：沉淀法沉淀法2.2.根据分子大小、形状的根据分子大小、形状的不同：不同：离心分离，膜分离，凝胶过滤离心分离，膜分离，凝胶过滤3.3.根据分子电荷性质的不同：根据分子电荷性质的不同：离子交换层析，电泳离子交换层析，电泳4.4.根据专一性结合的方法：根
3、据专一性结合的方法：亲和层析亲和层析5.5.其它：其它：吸附层析，疏水层析吸附层析，疏水层析(二二)纯化方法的排序纯化方法的排序先选用粗放、快速、先选用粗放、快速、有有利于缩利于缩小样品体积的方法。精确、小样品体积的方法。精确、费费时、时、需需样品少的方法，宜后样品少的方法，宜后选选用。用。二、纯化方案的评价二、纯化方案的评价(一一)酶活力测定：酶活力测定：酶活力酶活力(enzyme activity)又称酶活性，是又称酶活性，是指指酶催酶催化某化某一一化学反应的化学反应的能能力。其大小可用力。其大小可用 在一定的条件下，在一定的条件下，酶酶催催化某一化学反应化某一化学反应的的反反应速率来表示
4、。应速率来表示。一般用单位时间内产一般用单位时间内产物物生成的量来表示生成的量来表示酶催化的反应速率。酶催化的反应速率。方法：方法：在酶反应开始后不同时间，从反应系统中取出一定量反应系统中取出一定量反应液，用适当应液，用适当方法停止其反应后，再根据方法停止其反应后，再根据产产物物和底和底 物在物化性质上的差物在物化性质上的差别进行别进行分分 析析，求求 得单位时间的酶促反应变化得单位时间的酶促反应变化量。量。常用的方法：常用的方法：1 1.化学分析法化学分析法(比色法比色法):):产物可与特产物可与特定定的化学试剂反应生成的化学试剂反应生成稳稳定的有色定的有色溶溶液液。2.2.分光光分光光度度
5、法：法：利用底利用底物物和产物和产物光吸收性光吸收性质的不同。质的不同。3.3.量气法：酶促反应中量气法：酶促反应中产物或底物之一为产物或底物之一为气体。气体。4 4.滴定法滴定法(pH值测量法值测量法):):产物之产物之一是自一是自由的由的酸酸性物质或性物质或碱碱性物性物质质。多用多用pHpH 电极测。电极测。常用终止反应方法：常用终止反应方法：1)1)改变反应最适条件：改变反应最适条件：加酸、碱、加热加酸、碱、加热2)2)加酶变性剂：加酶变性剂：5%5%三氯乙酸三氯乙酸酶活力单位：酶活力单位：通常采用国际酶学委通常采用国际酶学委员会规定员会规定的单位。的单位。但在纯化过程中，为了方便，可采
6、但在纯化过程中，为了方便，可采用自行用自行规规 定的单位，只要达到可比较的目的定的单位，只要达到可比较的目的即即可可，如，如 直接以光密度值表示。直接以光密度值表示。常用常用比活力比活力表示表示酶酶制剂的纯度；制剂的纯度；酶活力酶活力(u/ml)(u/ml)比活力比活力=蛋白质含量蛋白质含量(mg(mg 蛋蛋白白/m/m 酶酶 液液)(二二)蛋白质浓度测定蛋白质浓度测定1.紫紫外吸收法：酪氨酸、色氨酸残基中苯环有共轭外吸收法：酪氨酸、色氨酸残基中苯环有共轭双键，在双键，在A,A,有最大吸收。有最大吸收。特点：简便、快速、不损耗样品，但干扰因素多。特点：简便、快速、不损耗样品，但干扰因素多。2.
7、双双缩缩 脲脲法：具有两个或两个以上肽键的化合物均法：具有两个或两个以上肽键的化合物均有双缩脲反应。优点：快速缺点：灵敏度差有双缩脲反应。优点：快速缺点：灵敏度差3.3.酚试剂酚试剂(Fol(Folin-in-酚酚)测定法：测定法：繁琐，但灵敏度、准确度高。繁琐，但灵敏度、准确度高。4 4.染染 料料结合法结合法(考马斯亮蓝考马斯亮蓝染色染色法法):又称又称Bradford法法，灵，灵敏敏、简、简便、便、快速、干扰少，快速、干扰少，是近年来常用的检测法。是近年来常用的检测法。(三三)提纯倍数与回收率：提纯倍数与回收率：酶的比活力比活力(纯度纯度)=)=活力活力单位数单位数/毫克蛋白毫克蛋白比活
8、力越高，酶纯度也越比活力越高，酶纯度也越好。好。表示酶制剂纯度的指标。表示酶制剂纯度的指标。纯纯化化倍数倍数=提纯提纯后比后比活活力力/提提纯前比活力纯前比活力表示提纯过程中纯度提高的倍数表示提纯过程中纯度提高的倍数。提纯倍。提纯倍数越大，表示该方法纯化效果越好大，表示该方法纯化效果越好。总活力总活力=酶活力单位数酶活力单位数酶酶液总体积液总体积即样品中全部酶活力。即样品中全部酶活力。回收率回收率=提纯提纯后后酶酶总活力总活力/提纯提纯前前酶总活力酶总活力110000%表示提纯过程中酶损失程度的大小。回收表示提纯过程中酶损失程度的大小。回收率率越越高，损失高，损失越越小。小。判断一个分离纯化方
9、法的优劣，常用判断一个分离纯化方法的优劣，常用总活总活力的回收率的回收率和和比活力的提纯倍数比活力的提纯倍数两个指标。两个指标。回收率：反映酶的损失情况。回收率：反映酶的损失情况。提纯倍数：表示方法的有效程提纯倍数：表示方法的有效程度。一个好的纯化步骤是回收率较高，提纯倍一个好的纯化步骤是回收率较高，提纯倍数也较大。数也较大。步 骤总体积(ml)蛋白浓度(mg/ml)蛋白总量(mg)酶浓度(u/ml)比活力(u/mg)蛋白总活力(u)产率(%)提纯倍数粗无细胞抽提液50热变性除杂蛋白硫酸铵分级(30%50%)饱和度沉淀部分DEAE-凝胶层析pH梯度(第5060管)经透析、浓缩离子交换层析(DE
10、AE-纤维素)KCl梯度洗脱，(第2131管)经透析、浓缩凝胶过滤葡聚糖凝胶G100(第3140 管)合并羟基磷灰石层析，酸盐梯度(第1518 管)合并100010002502551041283970.920.75120008000750225359.2354.811.0833641703750.4160.603.679.852185500500048002730220018201.700150010096554436.434301.001.448.8323.61254441200(四四)纯化表纯化表 酶的提取提纯酶的提取提纯记录表记录表表 1-1 酶的提纯过程记录格式(设想的提纯步骤)Ste
11、pStepVolumeVolume(ml(mlTotalTotal Protein(mgProtein(mgTotalTotal UniUnitstsSpeeificSpeeificActivityActivity(U/mg)(U/mg)YieldYield(%(%PurificatioPurification n(nfold)(nfold)Cell extract(NH)SO)factionationHeat treatmentDEAE chromatographyCM-celuloseBio-Gel A2.8002.8008080505070,00070,00025,40025,40016,50016,500390390474735352.,7002.,7002,3002,300,980,980,680,680,350,350每一步总活性将减少，比活性应每一步总活性将减少，比活性应明显提高明显提高)
