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1、本科学生综合性实验报告项目组长 高铭远学号 07070241011成 员杜广宇、杜沙沙、段司宇、冯慧彬、宫亚坡专 业生物技术班级1班实验项目名称小麦耐盐生理指标测定指导教师及职称开课学期2008 至 2009 学年2学期上 课 时 间2009年 4月 22日植物耐盐性生理指标的测定一、实验目的及要求通过本实验的学习，使学生掌握脯氨酸含量、过氧化物酶活性和丙二醛含量测定 方法，掌握单因子方差分析，培养学生离心机和分光光度计的使用技能，为今后撰写 毕业论文打下良好的基础。二、实验主要仪器和试剂仪器: 离心机；分光光度计；恒温水浴锅试剂：酸性茚三酮溶液；冰醋酸；标准脯氨酸溶液； 3磺基水杨酸；过氧化
2、物酶测定反应液；pH6.0磷酸缓冲液10%TCA； 0.6%TBA三、实验原理植物在盐胁迫下,植物可通过积累一定量的脯氨酸降低水势 , 维持植物体内的水 分平衡,保证植物的正常生长。脯氨酸本身是一种水溶性最大的氨基酸，它可以防止 原生质体的水分散失，在植物细胞生理干旱时，它的增加有助于细胞或组织保持水分。 用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚 三酮加热处理后，溶液即成红色，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在 520nm 波 长下比色，从标准曲线上查出脯氨酸的含量。植物在盐胁迫下，活性氧含量会明显增加，对植物体产生毒害，而过氧化物酶会 清除植物体内多余的活
3、性氧 。过氧化物酶广泛存在于植物的各个组织器官中。在有 过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶可以使愈创木酚氧化，产生茶褐色物质，在 470nm 处有最大吸收峰，可根据单位时间内A47o的变化值，计算POD活性大小。植物在盐胁迫下，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛是其产物之一，通常将其作 为脂质过氧化指标，用于表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。丙 二醛（MDA）是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥 酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮），其最大吸收波长 在 532nm 。但是测定植物组织中 MDA 时受多种物质的干扰，其中最主
4、要的是可溶性 糖，糖与 TBA 显色反应产物的最大吸收波长在 450nm，532nm 处也有吸收。植物遭 受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中 MDATBA 反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。四、实验步骤（一）实验材料的培养小麦种子吸胀8h后消毒、4C下春化30天，采用砂培法种植，至三叶期，作为 供试材料。（二）盐胁迫处理用100 mmol/L NaCl对小麦进行盐胁迫，以未进行盐胁迫为对照，以进行盐胁迫 为处理，盐胁迫3d后分别测定脯氨酸含量、过氧化物酶活性和丙二醛含量，对照和 处理分别重复3次。（三）脯氨酸含量测定1. 标准曲线的制作用100 口 g/ml脯
5、氨酸配制成2、4、6、8、10 u g/ml的标准溶液。取标准溶液各 2ml,加2ml3%磺基水杨酸，2ml冰醋酸和4ml2.5%茚三酮试剂于具塞试管中，置沸水 浴中显色1h,冷却后与波长520nm测定A值，以A值为纵坐标，脯氨酸浓度（ug/ml） 为横坐标绘制标准曲线。2. 脯氨酸的提取称取小麦叶片05g,加3%磺基水杨酸5ml研磨提取，匀浆移至试管中，在沸水 浴中提取10min，冷却后，5000rpm离心20min，上清液即为脯氨酸粗提液。3. 反应体系取上清液2ml，并加入1ml冰醋酸,2ml酸性茚三酮，混匀置于沸水浴中显色0.5h。 以2ml磺基水杨酸，1ml冰醋酸，2ml酸性茚三酮为
6、对照。在可见分光光度计下520nm 处测得A值。4. 脯氨酸的含量的计算 从标准曲线查得脯氨酸浓度，计算出样品中脯氨酸的含量，以每克材料鲜重含脯氨酸的微克数表示（口g/g）。（四）过氧化物酶活性的测定1. 过氧化物酶的提取称取小麦叶片0.2g，加5ml pH 6.0的磷酸缓冲液，再加入0.02g PVP-30 （除去酚 类物质的毒害，防止醌类物质的干扰）及少量石英砂研磨。4C, 5000rpm离心15分 钟，上清液为酶粗提取液2. 反应体系50 口 1酶粗提取液加入4ml反应液，在可见分光光度计下470nm处测A值，放入 后立即记时，每隔lmin记一次数值，连续记录三次，取平均值。3. 酶活力
7、定义 过氧化物酶活性以每克鲜重每分钟在 470nm 下 A 值的变化值，设每变化 0.01A 为一个酶活力单位。过氧化物酶活性=U/ming（五）丙二醛含量测定1. 丙二醛提取小麦叶片0. 5g，加入10%三氯乙酸（TCA）5mL（分两次加）和少量石英砂充分研磨， 匀浆液以5000r/min离心20min，上清液即为样品提取液。2. 反应体系取2mL提取液，分别加入2mL 0.6%TBA液，混匀，在试管上加盖塞，置于沸水 浴中沸煮15min，迅速冷却，离心。取上清液测定532nm和450nm下的A值。以2mL 水代替提取液调零。3. MDA含量计算：根据C = 6.45XA -0.56XA，计
8、算出样品提取液中丙二醛的浓度C，然后再计532450算出每克样品中丙二醛的含量（eol/g （FW）。五、实验结果标准液浓度00.40.81.21.62.0(ug/ml)027042-M0.11O.8 6 4 o o O o.ao.0. 02 -o 1111100.5115225处理脯氨酸浓度(ug/ml)脯氨酸含量117.73937.393901a488.0333231.259b对照处理A值含量或活性A值含量或活性(FW)(FW)脯氨酸1. 0.0471.109.67191. 0.1171.279.0875含量2. 0.0512.119.35282. 0.1872.448.50303. 0.
9、0533.124.19333. 0.3063.736.5095POD1.A值1.A值活性0.448, 0.569, 0.684, 0.7860.877, 1.112, 1.322, 1.511差值 0.121, 0.115，0.1021. 11266.67差值 0.235, 0.210, 0.1891. 21133.332.A值2.A值0.541，0.717, 0.875，1.0211.112, 1.389, 1.622, 1.807差值 0.176, 0.158, 0.1462.16000差值 0.277, 0.233, 0.1852. 23166.673.A值3.A值0.701, 0.88
10、0, 1.046, 1.1961.139, 1.434, 1.676, 1.869差值 0.179, 0.166, 0.1503.16500差值 0.295, 0.242, 0.1933. 24333.33丙二醛1.A450=0.408A532=0.1961. 51.7861.A450=0.544A532=0.2021. 49.913含量2.A450=0.397A532=0.1992. 53.06152.A450=0.447A532=0.2012. 52.30653.A450=0.443A532=0.2053. 53.70853.A450=0.504A532=0.1863. 45.873原始数
11、据：单因子方差分析结果：对14588.892887.97a22877.781619.443b52.8520.978222a49.364173.251676a六、结果分析本次实验所得结果中，脯氨酸含量和 POD 活性测得结果差异显著，但丙二醛含 量所测结果对照组与盐处理组差异并不十分明显，综合分析有以下原因： 由于本次实验时间较长，前后相差一个月左右，致使三次测定中实验材料存在差异。 麦苗所取部位不同，如叶部和茎部中脯氨酸含量、POD活性和丙二醛含量存在 的差异可能影响实验结果。 试验中，研磨不充分、石英砂和PVP加入不适量、每次水浴加热时间控制不精确等，都可能影响分光光度计测得结果，从而影响实
12、验结果。 由于测定丙二醛含量是，由多人测量，可能存在的误差较大，导致丙二醛含量两组差异不显著。 实验中存在一系列的机械误差，也可能是影响实验结果。七、思考题：1.为什么使用砂培法培养实验材料？ 沙培介质的通气性较好，可以保证根际有较好的通气性。 沙子的粒径较小，持水量较多，扩散范围大，根系能充分吸水吸肥，且根系水平方向伸展。 每次都用新鲜营养液，较好的维持养分平衡，减少调控营养液的麻烦。 持水量大，工业次数可减少，每天供液12次即可。 水和肥料的用量较多，吸收利用率也不高，易于产生盐类积累。 虽不易较精确控制，但仍可以调节PH。2分光光度法要求A值在多大范围内，数据才可靠，如何调整？在实际分析工作中，溶液的吸光度控制在0.20.7时，数据较为可靠。调整方 法：节“0”点。轻轻旋动调“0”电位器，使读数表头指针恰好位于透光度为“0”处（此时，比色皿暗箱盖是打开的，光路被切断，光电管不受光照）节T=100%。将盛蒸馏水（或空白溶液或纯溶剂）的比色皿放入比色皿座架中 的第一格内，有色溶液放在其它格内，把比色皿暗箱盖子轻轻盖上，转动光量调节器， 使透光度T=100%，即表头指针恰好指在T=100%处。
