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1、酵母菌的培养与观察实验方向：了解酵母菌的生长特性、种类，观察并对比土壤，水果及酒曲中酵母菌的形态及种类。一、实验目的 1.学会选择酵母菌在土壤中采样点并合理取样；2.掌握PDA培养基的配制方法；3.学习分离纯化酵母菌的基本操作技术，掌握微生物培养方法以及接种技术。4.学会使用高压蒸汽灭菌锅、显微成像系统等实验仪器设备；5.培养并学习微生物实验的一般思维及方法。二、 实验原理酵母菌是单细胞真核微生物。酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。比细菌的单细胞个体要大得多，一般为15微米530微米。酵母菌无鞭毛，不能游动。酵母菌在自然界分布广泛，目前已知有1000多种酵母
2、，根据酵母菌产生孢子(子囊孢子和担孢子)的能力，可将酵母分成三类：形成孢子的株系属于子囊菌和担子菌。不形成孢子但主要通过芽殖来繁殖的称为不完全真菌，或者叫“假酵母”。目前已知大部分酵母被分类到子囊菌门。大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH为4.56，常见于含糖份较高的环境，如果园土，菜地图及果皮等职务表面。酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养集中，酵母菌比霉菌生长的快。利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做可抑制细菌生长），然后再固体培养基上划线分离。三、实验器材1. 培养基配方PDA培养基：马铃薯（去皮）100g，蔗糖与葡萄糖分别10g，水500g，琼脂
3、10g.PDA乳酸液态培养基：马铃薯（去皮）40g，蔗糖与葡萄糖分别4g，水200g，乳酸1ml2. 仪器及其它用品小铲，500mL三角锥形瓶，500mL及300mL烧杯，药勺，无菌培养皿，剩9mL无菌水试管8支，无菌玻璃珠，接种环，酒精灯，称量纸，高压蒸汽灭菌器，超净工作台，移液器，分析天平，恒温震荡仪，微波炉显微成像系统。四、实验步骤与方法1. 样品收集（1）土壤样本：在花圃里找开花较多的花丛下离地面5-10厘米的土壤取一小块土壤，（2）水果样本：一小块腐烂水果，一小块新鲜水果（3）酒曲样本：一小块酒曲2. 培养基的制备 PDA培养基的制作把马铃薯去皮，切成小块状，称量100克，放进500
4、mL的水中用电热炉加热，边用玻璃棒搅拌，以免糊底，煮沸至马铃薯成糊状便停止加热。再用双层纱布放在大烧杯上，左手握住，右手戴上手套把马铃薯慢慢倾倒在纱布上，倒完便把纱布与滤渣拿起来把剩余的汁压挤出来。再用水补充至500mL，加8克葡萄糖及4克琼脂，搅匀后用报纸折成小方块放在瓶口上用手沿瓶口形状往下按并用橡皮胶扎紧，放于高压蒸汽灭菌炉中，用121度灭菌15分钟。待其冷却至45度左右便在无菌条件下倒在灭菌了的培养皿上。待其冷却凝结后便倒置放进培养箱中备用。乳糖PDA培养液：制法同上，但不加琼脂而加1ml乳酸，并分装进8支试管。3.培养纯化：接种：直接接入乳酸马铃薯葡萄糖培养液管中，置28-30，培养
5、24h，可见培养液变浑浊。富集：用无菌吸管去上述培养后培养液1ml,注入另一管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，置28-30再培养24h或稍长（过长则霉菌长出）。培养: .稀释样本：用1ml无菌吸管分别吸取1ml样品液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，制成10-1、10-2稀释度的样品溶液。.取样培养：用1ml无菌吸管分别由各稀释液中吸取0.2ml对号放入已写好稀释度的平板中，各加入几个已灭菌的玻璃珠，轻轻晃动，涂布均匀，然后将玻璃珠取出。将平板倒置于28恒温室中培养7日。（分别取培养两天，一天，及稀释1
6、0-1、10-2 的样品溶液，分别用涂布法与划线法做四个梯度四个样品的对比）。观察实验流程图土壤水果酒曲乳酸马铃薯葡萄糖培养液富集培养24h+24h观察分别用涂布法和刻线法接种至PDA培养基培养7天观察主要酵母菌的属介绍： 1. Schizosaccharomyces属：营养细胞圆筒形，分裂生殖形成子囊，主要在热带 代表种 S. pombe：是从非洲人的Pombe酒中分离出的酵母，酒精发酵能力很强。 Schizosaccharomyces octosporus：主要由果实中分离出。 Schizosaccharomyces pombe 2. Saccharomycodes属：出芽分裂的酵母，此属
7、只一种S. ludwigii，蔗糖会发酵，但对maltose不会发酵，故麦汁的发酵因maltose会残留可酿成具有甜味的酒。 3. Hanseniaspora属：柠檬形两极出芽，为果实上之野生酵母，在葡萄酒酿造初期会出现，不久即被淘汰。代表种为 H. valbyensis。 4. Saccharomyces属：酒精发酵能力很强，为酵母中最重要的属，是传统以来各类酒、制造酒精、制造面包等所使用的。细胞有球形、卵形或椭圆形，多极出芽。代表种有： S. cerevisiae =S. sake =S. ellipsoideus =S. cerevisiae var. ellipsoideus =S.
8、formosensis ? (or =S. cerevisiae var. formosensis? 早期台研396酿酒精菌种) 为制造啤酒、葡萄酒、清酒、酒精、面包等最常使用之菌种。 S. carlsbergensis =S. uvarum 从Carlberg的啤酒酿造场所分离之下面酵母(bottom yeast)。 S. bayanus =S. pastorianus 为不良酵母，造成啤酒发酵过程中有臭气产生，严重影响啤酒质量(有害菌)。 S. diastaticus 会分解dextrin & starch，不利于啤酒发酵，为啤酒制造过程中之有害菌。 S. rouxii =Zygosacc
9、haromyces major (酱油有益菌) =Z. soya (酱油有益菌) =Z. salus (有害菌，会于酱油表面形成皮膜) =Z. japonicus (有害菌，会于酱油表面形成皮膜) 为耐盐性酵母，在酱油胶中常被发现，为一种有用酵母 12. Cryptococcus属：为球状或卵形之细胞，无伪菌丝，细胞具粘性荚膜，无发酵能力，能形成starch-like物质。C. neoformans可感染人畜Cryptococcus症的病原菌。 13. Kloeckera属：只会发酵glucose，常见于果实及果汁中，柠檬形两极出芽细胞，代表种为 K. apiculata。 14. Rhodotorula属：会产生carotenoid色素，故称红色酵母，无发酵能力，但会污染食品。代表种为 R. glutinis，干燥菌体内脂肪量可达60%以上，与Lipomyces属同为具有油脂生产能力之潜力菌种。 会产生carotenoid红色色素的酵母还有 Sporobolomyces属 (具ballistospore)及Rhodosporidium属(会形成teliospore)。
