《HRP(辣根过氧化物酶)标记抗体的方法 (2).doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《HRP(辣根过氧化物酶)标记抗体的方法 (2).doc（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、HRP(辣根过氧化物酶)标记抗体的方法酶标记抗体HRP标记抗体原理及方法，戊二醛二步法和过碘酸钠法【医学基础免疫学实验指导】来源： 医学基础免疫学实验指导,主编金伯泉 李恩善,第1版.北京:世界图书出版社,1990 酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。
2、在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。(一)酶制剂及其底物凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋
3、白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH39,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反
4、应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下:HRPDH2H2O2D2H2O供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如DAB(3.3二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿色，二者的可溶性均好，
5、在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上。另外，还有一种供氢体称ABTS2, 2-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。应控制在经较短时间反应后呈色即达高峰（说明HO已消耗殆尽）。这样即使再延长时间也不会增加反应产物的颜色。(二)HRP标记抗体的方法酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简
6、易过碘酸钠法更为常用。戊二醛二步法1.原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。2.标记步骤：(1)称取HRP25mg溶于1.25戊二醛溶液中，于室温静置过夜。(2)反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。(4)用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混
7、匀后，置室温2小时。(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置41小时。(7)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。3.结果判定：(1)定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合
8、物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选择)。(2)定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。酶量(mgml)OD403nm0.4IgG量(mgml)OD280nm-OD403nm0.42)0.940.62酶量(mgml) IgG量(mgml) 酶量克分子比值 440,000 160,000IgG量(3)本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有24的酶与蛋白质结合。4.试剂及器材：(1)0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。(2)1.25戊
9、二醛液：取25戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。(3)1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。(4)0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。(5)0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。(6)PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。(7)萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。 (8)纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。(9)HRP(RZ3.0)。(10) Sephadex G-25层析柱(2cm50cm)。(11) 搅拌器，分光光度计，离心机。(12) 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。简易过碘酸
10、钠法本法是以NaIO先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70的HRP和Ig结合，99的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用的方法。1.原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的-和氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO氧化HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。2.标记步骤:(1)称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。(2)于上液中加入0.2
11、ml新配的0.1M NaIO溶液，室温下避光搅拌20分钟。(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4过夜。(4)加20l 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.09.5，然后立即加入10mg IgG(抗体，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。(5)加0.1ml新配的4mgml NaBH液，混匀，再置42小时。(6)将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4过夜。其余步骤(纯化)同戊二醛标记步骤的(6)、(7)、(8)。3.结果判定：除标记物IgG量的计算，略有不同以外，其余均同
12、戊二醛法。IgG量(mgml)(OD280nm-OD403nm0.3)0.624.试剂及器材:(1)0.1M NaIO：称取241mg高碘酸钠(广州化学试剂厂，批号830602)溶于蒸馏水10ml中。(2)1mM PH4.4醋酸钠缓冲液:0.2M NaAc (1.361克50ml) 3.7ml0.2M HAc (0.601ml50ml) 6.3ml加蒸馏水至2,000ml。(3)0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液:NaCO 0.32克NaHCO 0.586克加蒸馏水至50ml再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。(4)NaBH溶液(4mgml):临用时称取NaBH4m
13、g溶于1ml蒸馏水中。(5)其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。(三)工作浓度的选择在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。酶标记抗体的滴定方法是：将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。其步骤为：先将抗原(或抗体)用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10g
14、ml左右，于聚苯乙烯板孔内加0.1ml，4过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1BSA-PBS液依次稀释成1100，1200，1400，1800，11600?(根据据抗体的滴度而定)，分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.1ml，37孵育1小时后洗涤。然后加底物液，每孔0.1ml，371030分钟。以2M HSO 0.05ml终止反应。结果判定主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。并以OD为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。有关试验的试剂及器材均见ELISA部分。要说明的是，本法为ELISA直接法，所测的工作浓度与在实际应用中的最适浓度可相差几个滴度。这就要求在建立ELISA实验系统中，因此基础上还应进一步确定实际工作浓度(可采用方阵法)，以达到最适的实验条件。(四)注意事项1.在具备高质量HRP的条件下，所要标记的抗体也要活性高
