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1、摘要几乎在每一个生物研究中,减少卡路里的摄入量可以延长寿命。在酵母中，通过限制饮食来延长寿命被认为是通过高转化，雷帕霉素的营养相应目标，蛋白激酶A和Sch9激酶调控的。这些激酶协调规范各种细胞过程，包括压力回应，蛋白转换，细胞生长和核糖体生源说。我们这里研究一种特殊的核糖体的60S的减少量水平表明酵母的老化程度。编码60S活性蛋白基因的缺失或者加工条件或者一个小分子的处理，这些都会抑制60S的生源说。每个都足够很大程度增加复制寿命。一种通过减少60S活性水平来影响持续寿命的机制是通过一种回应营养的转录因子Gcn4的感应。遗传的异位显性分析表明通过饮食限制，减少60S的充裕和激活Gcn4来延续酵
2、母寿命的机理是一样的。介绍无脊椎生物模型作为寿命研究的宝贵工具，主要是因为他们寿命短和基因调控很方便。最常用的被用来作为生物模型的包括果蝇，线虫和酵母。在酿酒酵母的萌芽阶段，细胞老化的两个模型已经成熟，复制，自然老化。复制寿命被定义为有丝分裂周期的数目，一个在衰老之前的母细胞可能主导在多细胞有机体的有丝分裂的活跃细胞的老化。一个不发生细胞分裂的酵母细胞在稳定期保持活性并可能指导有丝分裂后期细胞的老化，这个时间的长度叫持续寿命。 限制饮食延长寿命并且延迟与年龄有关的疾病的开始在各种各样的进化的相异的生物体适用，包括哺乳动物。在酵母中，通过减少培养基中葡萄糖或氨基酸浓度来限制饮食能同时导致持续寿命
3、和复制寿命的延长。基因的异位显性实验支持这个假说，酵母由于限制饮食延长寿命是受三种相应营养的激酶调节的：雷帕霉素的目标，Sch9，蛋白激酶A。减少这些激酶的活性延长持续寿命和持续寿命。对于营养盐，这三种激酶调节多种重要的细胞过程，包括核糖体的生化发生，应激反应，自我吞噬，线粒体的逆行代谢。通过TOR1或者SCH9的缺失延长寿命没有限制饮食的加入，独立于Sir2蛋白脱乙酰酶。 TOR是第一个被定义为酵母寿命的调节者通过酵母564链的随机筛选，每一个缺乏不重要的单个基因。伴随着TOR1和SCH9，在TOR传信号的过程中减少几个其他基因被定义为长寿，包括RPL31A和RPL6B。对rpl31a和rp
4、l6b长寿的观察表明通过抑制饮食可能减缓复制寿命的机制是通过减少核糖体蛋白的产生在TOR和Sch9的下游调节过程中。几个报道已经不断的连接核糖体激酶下降水平和延长寿命的关系在酵母和C线粒体中。RPL10和RPS6B或者RPS19A的缺失增加了酵母的RLS。在C线粒体里，九个不同的40S亚族RP基因和七个不同的60S亚族RP基因的独特组合已经被报道可以延长寿命。而且，几个翻译起始因子包括eIF2 b/g, eIF3A/B/F, eIF4A/E/G, or eIF5A同源染色体的抑制已经表明增加C线粒体的寿命。核糖体蛋白S6激酶的抑制已经和蠕虫和蝇类的寿命延长有关，最近的数据表明Sch9是酵母S6
5、激酶的功能直接同源。 为更好了解核糖体蛋白和寿命的关系，我们测量复制寿命根据呈现在酵母缺失系列的每个107RP基因缺失链并决定许多不同的60S RP基因缺失延长了复制寿命。我们不断发现通过减少60S特别核糖体加工过程或用小分子处理来减少核糖体60S的数量也导致复制寿命的增加。异位显性分析允许我们下这样一个结论：缺失60S延长寿命和限制饮食和独立Sir2是一样的机理。最后我们发现转录因子Gcn4需要减少突变体的60S延长复制寿命，表明Gcn4是一个新奇的促进长寿功能的因子。结果核糖体蛋白基因缺失链的长寿分析酵母核糖体由两个亚基组成，一个小的40S和一个大的60S，这两个共同包含了四个离散的rRN
6、A物种和78个核糖体蛋白。在酵母中，大约核糖体蛋白基因的85%呈现在复制品中，考虑到每个间接同源的可行缺失，但一般不是所有同源同时发生。在编码RPs的134个基因中，第107个在MATa ORF缺失链中被认为是控制质量已证实的缺失。我们测量复制寿命，这些107RP单个基因缺失链的每一个，对应46RP间接同源组和15不成对的RP基因，其中三组是非必要的单个复制基因，十二组有不代表缺失系列的旁系同源。对107RP基因缺失链进行分析，第28被发现能延长寿命和在MATa缺失系列匹配的实验野生细胞有关。为验证这个结论，我们检测了第28对应的缺失基因的复制寿命来源于MATa ORF缺失系列。总之，第14R
7、P基因缺失链被证明能对MATa和MATa ORF缺失系列延长寿命。基于前面的研究，我们期望对107随机选择的缺失链产2-3链能很大图1.RP基因缺失菌株寿命图验证了14基因有效地增加了菌株寿命,每一个菌株都缺乏一个RPL基因。(A-C)寿命曲线显示了在MATa和MATa ORF缺失系列中显著增长寿命的RP缺失菌株(p0.05)。数据从马塔混合菌和马塔删除,experiment-matched野生细胞被显示出。平均寿命都显示在括号中。(请参见表S1)。程度增加复制寿命有类似的分析；所以，已经证实能长寿的RP基因缺失的百分比很大，接近不必要的ORFs整个系列的五倍。显然，14条所有被证实能延长寿命
8、的RP基因缺失链缺少由60S单位组成的蛋白，然而缺失序列不缺少编码被证实能延长寿命的40S序列蛋白的RP基因。一些长寿rp突变体，例如rp22a和rpp2b,导致寿命延长超过50%，长寿可以比得上在酵母中报道的最长寿的单个基因缺失突突变体。不是所有rp菌株长寿，有些短寿，例如rp20a.这些发现表明大亚基（RPLs）的核糖体蛋白是酵母长寿的重要的决定因素。RPL间接同源缺失菌株的长寿差别尽管很多RPL基因缺失是长寿的，但很多不长寿。为描绘这些显然的特征，我们进一步检测间接同源，其中一个基因缺失很明显增加复制寿命，而缺失另一个没有。例如，rp31a和rp20b增加复制寿命，但是他们相应的间接同源
9、却是基因不增加寿命。由大多数复制寿命间接同源对编码的蛋白产物比98%完全相同的好。在Rpl31a和Rpl31b中，只有一个保守的氨基酸变化区分间接同源。因此，不可能这两个间接同源RP蛋白质中一个演变成一个特别的长寿调节功能，在这种情况下，rp间接同源对有相异的复制寿命显型。而且，我们发现复制寿命和其他在核糖体蛋白中报道过的功能角色没有联系。 对于在间接同源对缺失菌株中相异的复制寿命显型的一个可能的解释是，一个间接同源被比另一个高水平转录，造成占由间接同源产生的总蛋白不成比例数量。为测试这个可能，我们通过独立于三个独立的野生型菌株培养基的RNA定量RT-PCR分析来检测两个复制寿命间接同源对的表
10、达，用特殊间接同源引物。在RPL31A情况中，它的mRNA转录物比RPL31B的多，与rp31b细胞比较符合rp31a细胞的寿命。但对于几乎克分子数相等稳定状态的mRNA 水平RPL20A/B间接同源，这个关联没延伸。因此，简介同源对中的翻译偏见不能考虑到每一个相异的复制寿命显型。 为控制转录，酵母细胞能用许多机制去调节核糖体蛋白的水平，包括mRNA间接，转录起始和过量蛋白质的翻覆。为更直接的分析是否一个间接同源的缺失确实影响了产生蛋白的整个数量，我们分析整个多核糖体轮廓因为受限于特殊核糖体的细胞应该显示相应的亚基数量的减少。多核糖体轮廓由几个rp间接同源对在高盐条件下产生（去破坏不能翻译的8
11、0S单体）（图2D, 2E, and S1）。在研究的所有例子中，60S亚基水平和整个多核糖体轮廓减少当rp间接同源增加复制寿命。 变形的多核糖体模型（图2D and 2E）表明，在这些长寿的突变体中翻译减少了。在酵母中，翻译中足够的减少将减缓生长率。为判定核糖体蛋白链的增长速度是否是长寿的预兆，我们测量了每一个107rp链的倍增时间（表S3），比较了增长速度和野生型相关的平均复制寿命变化的百分比（图2F）。RPL基因缺失链的集合和关于增长率和复制寿命关系的RPS基因缺失链的集合有显著差别。由于rp链集合增长速率和复制寿命相反，而观察到了rps 链相反的趋势。但是rp链的增长速率分析因为开放阅
12、读框缺失系列中的RP基因缺失链增长缓慢的抑制基因的严重缺失而很复杂。我们观察到三种不同的情况，当增长率抑制基因自发在来至缺失系列的rp菌株中产生突变体（详见补充数据）。我们怀疑rp菌株中增长速率和复制寿命的反比关系将更加明显，如果它可能阻止抑制增长速率因素的自发突变。无论如何，这些数据表明RPL基因缺失链中差异的长寿潜能和功能60 S的数量相关，由多核糖体属性或全部的翻译速率表明。不重要的60 S加工过程的缺失增加寿命如果在长寿rp菌株中复制寿命的延长是由于减少60 S亚基水平，那么对60 S成熟很重要的非核糖体蛋白的突变体可能延长寿命。为检验这个假说，三个基因缺失链nop12 ，loc1和s
13、sf1 ，他们中每个在前60 S亚基成熟的不同阶段都缺少一个因素。loc1的缺失先前已经表明引起减少60 S亚基的充裕，相似的60 S亚基耗损被观察出来了，在ssf1 的多核糖体轮廓或和野生型相关的nop12 细胞（图3A）。和我们预测的一致，这些缺失突变体每个都比野生型细胞复制寿命长。（图3B） 在我们先前报道的564随机缺失突变体中，缺失REI1或YBR266C延长复制寿命。这两个ORFs朝相反的方向编码。已经决定这两个突变体的缓慢升长表型是由于Rei1功能的缺失，与被认定可能和不可能编码功能蛋白的Ybr266c无关（图S3）。Rei1最近与前60 S加工的后阶段有关。像nop12 ，ss
14、f1 和loc1细胞，Rei1细胞已经减少了60 S亚基（图3A）。因此，我们下结论削弱60 S成熟的不必要的突变能增加复制寿命，和缺失大亚基RP基因相似的方式。60 S成熟药理学抑制增加寿命我们下一步判定是否复试寿命的延长能通过药理学耗尽60 S亚基水平介入来达到。Diazaborine是种合成抗生素，反作用于革兰氏阴性菌，已经表明能减少酵母的60 S核糖体亚基水平，像涉及前rRNA加工的机制一样。与前面的结果一致，Diazaborine尚不致死的浓度（15 mg/ml）减少60 S亚基富裕（图3A）很 大程度增加复制寿命（图3C）。 相似，我们判定添加尚不致死浓度的一般翻译抑制剂环己酰（1
15、0100 ng/ml）到培养基中的影响。最低浓度的环己酰亚胺检测结果导致生 长速率适度的减少，然而，最高的浓度大体上减慢了生长。和Diazaborine对比，环己酰亚胺既不增加复制寿命（图3C 和 S4）也不导致60 S亚基水平的减少（图3 A）。因此，用Diazaborine60 S 亚基药力学的耗损但不用环己酰亚胺的一般的翻译抑制剂，足够增加酵母的复制寿命。60 S亚基缺失增加寿命独立于Sir2增强Sir2的活性增加酵母的复制寿命，一种有影响的想法，受染色体外的rDNA环(ERC)状的阻遏调节。相似的，FOB1的缺失，编码rDNA复制叉的阻遏蛋白，通过限制ERCs的累积来延长酵母的复制寿命
16、。因为Sir2和FOB1调节rDNA的重组，他们可能也通过调制rDNA的转录速率来影响60 S亚基水平。和这个观点相反的是，既不是Sir2的超标达也不是FOB1的缺失对60 S亚基水平或全部的与野生型细胞有关的多核糖体轮廓的可检测的影响。 只有通过缺失FOB1来ERC水平保持低，通过DR（生长在减少葡萄糖的培养基上或DR的基因模型中）延长复制寿命，独立于Sir2。相似的，RPL31A的缺失或者用diazaborine处理过的很大程度增加sir2 fob1细胞的复制寿命（图4B和4C）。这些数据表明，和tor1 或sch9相似，60 S亚基缺失延长独立于Sir2的寿命。60 S亚基缺失延长寿命通过和DR相似的机制在DR期间，TOR 和 Sch9的
