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1、钼蓝比色法2 H4 i+ f ?/ l: # _: C（1）仪器： e$ H p2 y- a, i9 d瓷坩锅或石英坩锅、紫外分光光度计、移液管（5 ml、10ml）、电炉高温炉、漏斗、容量瓶：100,500,1000ml、表面皿、烧杯、量筒、恒温水浴锅、坩锅、试剂瓶等。4 f-G（2）试剂：( ?* V! Q! x- L% a、 50%氢氧化钾溶液/盐酸、硫酸、氧化锌、滤纸、0.015%硫酸联氨溶液； 8 * / z b、 2.5%钼酸钠稀硫酸溶液：量取140ml硫酸注入300ml水中,摇匀,冷却至室温，加入12.5g钼酸钠,溶解后加水至500ml,摇匀,静置24小时备用。+ k# o& K
2、$ d) f& Q9 k) X9 X5 Q! Kc、 磷标准溶液：称取无水的磷酸二氢钾0.4391g溶于1000ml水中作为1号液，含磷0.1mg/ml，吸取1号液10ml，加水稀释至100ml含磷0.01mg/ml作为2号液，比色用。 nnx4 j. ! ; i! E! Q（3）操作方法： & K& ? y2 e8 l. c6 z Z- a、绘制标准曲线8 5 N1 _* H4 S( Q以吸光值为纵坐标，以磷（0.01、0.02、0.04、0.06、0.08mg）为横坐标绘制标准曲线。比色管号1 24682号标准液/ml12468蒸馏水/ml98642硫酸联氨溶液（5%）8ml钼酸钠稀硫酸溶
3、液2ml加塞摇匀，去塞，置于正在沸腾的水浴中加热10分钟，取出冷却至室温，用水稀释至50ml，充分摇匀10min分光光度计计在波长650nm测定吸光值7 I7 r+ io: b、制备被测液:用坩锅称取试样约10g(准确至0.001g)，加氧化锌0.5g，先在电炉上加热炭化，然后送入550600的高温炉中灼烧至灰化(白色)，灼烧时间约2小时,取出坩锅在干燥器中冷却至室温，用热盐酸(1:1)10ml溶解灰分，并加热微沸5分钟，将溶解液过滤，注入 100ml容量瓶中，用热水冲洗坩锅和滤纸，待滤液冷却至室温后，用50%氢氧化钾溶液中和至出现浑浊，缓慢滴加盐酸使氢氧化锌沉淀全部溶解后，再滴2滴，最后用水
4、稀释至刻度，摇匀。0 m2 c、比色：8 M T: E S9 J用移液管吸取被测液10ml注入50ml比色管中,加入0.015%硫酸联氨8.0ml，加2.0ml钼酸钠稀硫酸溶液，加塞, 摇匀, 将比色管置于正在沸腾的水浴中加热10分钟,取出冷却至室温，用水稀释至50ml充分摇匀，经10分钟后，用分光光度计在650nm下，用1cm液槽，用水调整零点,测定消光值。* % * Q6 g h8 y; l9 d、结果计算： 5 Y4 v2 $ s: 0 N1 Q0 根据被测液的消光值，从标准曲线查得磷量(p)，按公式计算磷脂含量微波消解-分光光度法测定食品中磷试剂:1、硝酸, 优级纯。2、15%( v/
5、v)硫酸溶液。3、50g/L钼酸铵溶液:(取5g钼酸铵固体, 用15%的硫酸溶液稀释至100ml 。)4、200g/L亚硫酸钠溶液: (根据每次的使用量, 称取一定量的亚硫酸钠固体, 溶解到相应的蒸馏水中即可)(每次使用前临时配制)。5、对苯二酚溶液: 取0.5g(对苯二酚固体溶解并定容到100ml 并在配好的溶液中加入一滴浓硫酸。)6、磷标准贮备液( 1000ug/ml): 称取预先在105干燥至恒重并保存于干燥器中的磷酸二氢钾(优级纯) 0.4393g溶解于蒸馏水中, 并定容至1000ml 。7、磷标准使用液( 10ug/ml):取磷标准贮备液进行逐级稀释, 使最后浓度为10ug/ml。仪
6、器微波消解炉、内衬杯、分光光度计标准曲线的制备：分别吸取磷标准使用液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml至8支10ml比色管中, 依次加入1ml钼酸铵溶液、0.5ml亚硫酸钠溶液及0.5ml对苯二酚溶液, 加蒸馏水定容到10m,l 摇匀, 静置30min, 在波长660nm处测定其吸光度, 根据测定值绘制标准曲线。参考文献：1 姚祖江.微波消解测定食物中磷含量.食品科学,2010(13):326-3282 李淑敏,应波. 微波消解-分光光度法测定食品中磷. 中国卫生检验杂志,2005,11(15):1295-1297.中华人民共和国国家标准 食物中磷的测定方法原理
7、 食品中的有机物经酸破坏以后，磷在酸性条件下与钼酸铵结合生成磷钼酸铵。用氯化亚锡、硫酸肼还原磷钼酸铵生成蓝色化合物钼蓝。蓝色强度与磷含量成正比，可进行比色定量。试剂1 硝酸。 2 硫酸：比重1.84。 3 高氯酸。 4 15%硫酸溶液：取15mL硫酸，加入到80mL水中，混匀。放冷以后用水稀释至100mL。 5 5%硫酸溶液：取5mL硫酸，加入到90mL水中，混匀。放冷以后用水稀释至100mL。 6 3%硫酸溶液：取3mL硫酸，加入到90mL水中，混匀。放冷以后用水稀释至100mL。 7 钼酸铵溶液：称取5 g 钼酸铵（NH4）6Mo7O 244H2 O 用 15%硫酸稀释至100mL。 8
8、氯化亚锡-硫酸肼混合液：称取0.1g氯化亚锡（SnCl 2 2H2 O），0.2g硫酸肼（NH2 NH2H2 SO4），加 3%硫酸溶液并用其稀释至 100mL。此溶液置棕色瓶中，贮冰箱至少可保存一个月。 9 磷标准储备液：精确称取在105干燥至恒重的磷酸二氢钾（优级纯）0.4394g，用水溶解于 100mL 容量瓶中，并加水至刻度，混匀。此溶液每毫升含 1mg磷。置聚乙烯瓶贮于冰箱中保存。 10 磷标准使用液：准确吸取磷标准储备液 1.00mL 于 100mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。此溶液每毫升含10g磷。仪器：分光光度计。样品处理称取各类食品的均匀干样0.10.5g于100mL三
9、角瓶中，加硝酸15mL，高氯酸2mL，硫酸2mL，混匀。于电热板或电炉上小火加热消化，瓶中液体开始变棕黑色时，不断沿瓶壁补加硝酸至有机质分解完全，加大火力，至消化液发生浓密的白烟，溶液澄明或微带黄色。消化液放冷，加水 20mL。放冷以后转移至 100mL 容量瓶中，用水多次洗涤三角瓶，合并洗液于容量瓶中，加水至刻度，混匀。作为样品测定溶液。 取与消化样品同量的硝酸、高氯酸、硫酸，按同一方法做试剂空白溶液。标准曲线绘制取磷标准使用液0 、0.2、0.4、0.5、0.8、1.0mL（相当于磷 0、2、4、6、8、10g），分别置于25mL比色管中，各加水约15mL、5%硫酸溶液2.5mL，钼酸铵溶
10、液2mL，氯化亚锡-硫酸肼混合液0.5 mL，各管均补加水至25mL，混匀。在室温放置20min 以后，用2cm 比色杯，在660nm 波长处，以零管作参比，在分光光度计上分别测定其吸光管，以吸光度对磷含量绘制标准曲线。样品测定 准确吸取样品测定溶液12mL及同量的试剂空白液，分别置于25mL比色管中，各加水约15mL，5%硫酸溶液2.5mL， 钼酸铵溶液2mL，氯化亚锡-磷酸肼混合液0.5mL。各管均补加水至 25mL，混匀。在室温放置20min 以后，用2cm比色杯，在660nm 波长处，用水作参比，在分光光度计分别测定其吸光度。以测出的吸光度在标准曲线上查得未知液的磷含量。计算 X= （c-c0）*V1mV2*(100/1000) 式中：X样品中磷含量，mg/100g； c由标准曲线上查得样品测定溶液中磷含量，g； c 0 空白溶液中磷含量，g； m样品质量，g； V 1 样品消化液的总体积，mL； V 2 测定用样品消化液的体积，mL。
