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1、黄酮提取工艺设计思路1、黄酮类化合物含量测定的原理在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在条件下，黄酮类化合物与铝盐生成螯合物，加入氢氧化钠溶液后显红橙色。黄酮类化合物能与金属离子络合产生有色反应，于波长510nm附近有吸收，可用分光光度法进行测定。实验采用在碱性条件下，亚硝酸盐存在时，硝酸铝与黄酮形成红色络合物，在波长510nm附近有吸收可进行比色分析。在中性或弱碱性及硝酸钠存在条件下，黄酮类化合物与铝盐生成鳌合物，加入氢氧化钠溶液后显红橙色，硝酸钠还原黄酮，加硝酸铝络合，加氢氧化钠使黄酮类化合物开环，生成2-OH查耳酮而显色。利用黄酮类化合物中的3羟基、4羟基、5羟基、4羰基或邻二位酚羟基，与Al3进
2、行络合反应，在碱性条件下生成红色络合物的原理测定其含量2、测定波长的确定取样品溶液和标准溶液2mL，加70 %的乙醇至5 mL, 然后加入5 %的NaNO2 溶液1 mL, 室温放置6min, 再加入10 %的Al(NO3)3 1mL, 混匀, 室温放置6 min, 加入4%的NaOH 10mL, 用水稀释至25 mL,混匀, 放置15 min, 在分光光度计上扫描波长从400 nm600 nm 之间的吸收度, 结果在510nm 波长处有最大吸收值。配合物在Kmax1= 354nm 及Kmax2= 510nm有两个吸收峰, 经实验后得出Kmax1= 354nm波长处得到的工作曲线线性关系及精密
3、度数据均不佳, 故本实验选取Kmax2= 510 nm为测定波长。3、标准溶液的配制精确称取105干燥恒重芦丁对照品50mg, 加乙醇适量, 使之充分溶解, 用乙醇定容到100mL, 摇匀, 制得芦丁溶液。精确量取芦丁溶液20mL, 置于50mL容量瓶中, 用水稀释至刻度, 摇匀, 即得对照品溶液。每1mL溶液含芦丁对照品0.2mg。或精密称取干燥至恒重的芦丁标准品10mg, 置50mL容量瓶中, 加无水乙醇20mL, 轻摇使充分溶解,定容, 摇匀, 得0. 2mg /mL芦丁标准液。精确称取芦丁标准品5mg，用70%乙醇溶解，于50 mL容量瓶中定容，即得每1mL溶液含芦丁对照品0.1mg芦
4、丁标准品溶液。称取约20mg芦丁标准品于称量瓶中置105烘箱下烘干至恒重,干燥器中冷却，精确称取10 mg芦丁标准品，用70%乙醇定容至100 ml为标准液。4、样品溶液的测定方法4.1、标准曲线的绘制精确量取对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL, 分别置于25mL容量瓶中。分别加水至6mL, 加5%亚硝酸钠溶液1.0mL, 混匀, 放置6min; 加10%硝酸铝溶液1.0mL, 摇匀, 放置6min; 加1% 氢氧化钠溶液10.0mL, 再加水至刻度, 摇匀, 放置15min。用分光光度法在510nm波长处分别测定其吸光度。以吸光度为纵坐标, 浓度为横坐标,
5、用最小二乘法对直线进行回归计算，令回归方程为：y=ax+b，绘制标准曲线, 得回归线方程: Y = 11. 321 43X + 0. 00343( r= 0.9998), 在840g/mL的范围内，浓度与吸收度有良好的线性关系。分别取0. 0、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0 mL的0. 1mg/mL芦丁标准溶液于6支比色管中，分别加入0. 3 mL 5%亚硝酸钠，放置6 min，加0. 3 mL 10%硝酸铝后放置6 min,，再加1. 0mol/L NaOH 4.0mL，加70%乙醇定容至10 mL，摇匀，放置12min得测定液。以空白溶液作参比,在= 510nm处测吸光度
6、,计算标准液浓度(C)与吸光度(D)的回归方程D = bC + k。精确吸取芦丁标准液0、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0 ml分别置于6支具塞试管中，各补70%乙醇至5. 0ml，加5%亚硝酸钠溶液0. 3 ml,，摇匀，放置6 min后，加10%硝酸铝溶液0. 3ml,摇匀，放置6 min后，再加4%氢氧化钠溶液4. 0ml，加水0. 4ml，摇匀，放置15 min后，在510 nm处测吸光度-浓度值，所得吸光度-浓度曲线见图，回归方程如下: A =12. 721 0C - 0. 02903，相关系数r = 0. 9998。4.2、样品处理取采回的新鲜芦蒿叶，洗净，参考相关
7、文献，在105烘至约八成干,剪成约1 cm长度，用粉碎机粉碎，再在105烘至恒重。采用Soxhlet提取法，以无水乙醚为脱脂剂,于43水浴中脱脂至充分除去样品中脂类和脂溶性色素。取出样品滤纸包，先置通风处晾干，再将滤纸包置烘箱中130 烘干，放入干燥器中冷却备用。4.3、样品处理方法湿热法：将鲜叶置于高压反应釜加压蒸30min，另取鲜叶常压蒸30min。将阴干叶置于高压反应釜加压蒸15min，另取阴干叶常压蒸15min。氧化法：（1）H2O2法：将鲜叶、阴干叶分别用用2倍量H2O2浸泡10min（H2O2浓度1%、温度50）、10min（2%、40）、30min（0.5%、30）、30min（
8、2%、50）、60min（0.5%、40）、60min（1%、30）。（2）KMnO4法：将鲜叶、阴干叶分别用用2倍量KMnO4浸泡10min（KMnO4浓度1%、温度50）、10min（2%、40）、30min（0.5%、30）、30min（2%、50）、60min（0.5%、40）、60min（1%、30）。4.3、样品溶液的测定4.3.1、分光光度法精确量取样品溶液5. 0 mL, 置于25 mL容量瓶中, 按照2.1中方法进行操作, 在510nm 波长处测定吸光度A1; 再精确量取样品溶液5.0mL, 置于25mL容量瓶中, 加水至刻度, 摇匀, 在510nm 波长处测定吸光度A2。取
9、2次吸光度的差值, 由回归线方程计算样品中黄酮类化合物的提取率。4.3.2、HPLC 法取上述样品总黄酮提取液浓缩物，用甲醇溶解，进样前用0.45 m 滤膜过滤。高效液相色谱仪：LC- 9A(日本SHMADZU) ；色谱柱：Dima Technologies(C18 迪马公司)，规格：250 mm4.6 mm；柱温为室温；流速1 mL/min；检测器：SPD-10A；检测波长254 nm；进样量20 L；流动相：80%甲醇。在进柱之前，流动相要经过0.45m 的有机膜过滤，并超声脱气30 min。5、溶剂选择分别称取样品1g，以提取温度90，提取时间2 h ，分别利用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯
10、、氯仿、石油醚为溶剂，料液比1:50(g/mL)为提取条件进行常压回流提取，以此结果进行比较。6、线性范围、回归方程和检出限总黄酮的线性范围在1.040g/ml 之间，所得回归方程为y=0.0033x0.0109，相关系数为0.9995，检出限为1.0g/ml。7、显色剂稳定性实验精确量取标准溶液和样品提取液1.0mL, 同标准曲线和样品测定的操作，分别于配制后每隔5min测定其吸光度考察反应体系的稳定性。结果显示其RSD值为0. 5097% , 说明样品溶液在1h内稳定。8、加标回收率实验取已测得黄酮类化合物提取率的样品溶液2.0mL, 加入0.2mg/mL的芦丁对照液1. 0mL, 按实验
11、方法测定, 计算回收率。加样回收率为99. 12%, RSD 值为2. 135%。表明, 该方法对黄花菜中黄酮类化合物提取率测量的准确度较高。回收率= (混合后测得的总黄酮含量-样品中总黄酮含量)/芦丁标准品加入量100%。分别取0.2g含总黄酮的样品于两支15ml具塞比色管中，各加入4ml乙醇，其中1管加入0.100mg芦丁标准品作为加标测定管，另1管作为本底管，再按最佳试验条件进行样品处理，用标准曲线法进行计算，重复试验3次，计算回收率。由表8可知，该方法的回收率为95%104%，证明该方法的准确度较好。取5个10mL比色管，在已知黄酮含量的蓖麻叶和蓖麻花提取液中分别加入0.2mg/mL芦
12、丁对照品溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL样液，分别测定黄酮含量，根据所得的总黄酮含量减去加入的标量，再除以样品所含的总黄酮量即可计算出回收率。回收率%= 样品加标准样测得总黄酮含量样品中总黄酮含量/加入标准液总芦丁的含量100%序号样品测定值（mg/ml）加标量/mg加标后测定值mg /ml回收率/%平均回收率/%RSD/%10.200020.200030.200040.200050.20009、精密度实验取5份同一样品溶液各5.0mL, 置于25mL容量瓶中, 按实验方法测定，计算其平均含量和相对标准偏差。其RSD 值平均为0.162%, 测定结果的相
13、对标准偏差很小, 说明仪器的精密度较高, 实验数据可靠。在正交试验得出的最佳条件下，样品用超声波提取后测定总黄酮提取量，重复试验5 次，计算保健食品总黄酮提取量为（5.3700.092）mg，RSD 为1.717%，证明该方法的精密度较好。按微波提取法同时制备5份试样液，按标准曲线方法对试样液中总黄酮含量进行平行测定。 精密称取车前草供试品3份，每份测试3次,结果见表2，相对标准偏差为3. 20 %(m =3)。精密移取芦丁标准液1mL，共5 份，分别置于10mL试管中，按1.3.3.2 节操作，计算吸光度的相对标准偏差(RSD)。10、重现性试验。取同一批大白口蘑样品6份，在最佳条件下进行萃
14、取，分别测定各自的总黄酮含量，结果表明，其相对标准偏差为1.24%。在同一实验室、不同时间对样品叶中总黄酮含量进行5次重复测定。11、金属离子的干扰实验银杏叶提取物作为生物活性物质, 许多金属离子对它的测定都有一定影响。本实验选取常见的Zn2+ 、Fe3+ 进行实验。实验表明Zn2+ 对反应无影响, 加入1 mL 100Lgm L Fe3+ 溶液, 扫描发现在波长510 nm 无吸收峰, 由此可知Fe3+ 对实验测定影响很大。本实验选择EDTA做掩蔽剂。12、黄酮类化合物的定性检测12.1、三氯化铝反应取8支试管，分别加入少许经上述各提取方法所得的样品，用95%乙醇完全溶解，每只试管中再加1%
15、三氯化铝乙醇溶液12 mL，观察颜色变化情况。在三氯化铝反应中，原来的黄色加深，并有黄色或黄绿色荧光，原因是与铝离子产生了螯合物而呈现出鲜黄色。滤纸上无明显颜色变化，紫外灯下显鲜黄色荧光，可能不含4-羟基黄酮醇和7，4-二羟基黄酮醇等黄酮类化合物。黄色或黄绿色：有黄酮类化合物。12.2、盐酸-镁粉还原反应将经上述各提取方法所得的样品分别溶于盛有95%乙醇的试管中，待完全溶解后加少许镁粉，再加数滴浓盐酸,观察颜色变化情况。在盐酸- 镁粉还原反应中,溶液呈现出橙黄色或紫红色,这是由于黄酮类化合物被还原生成花色苷元及其二聚物。试液呈现红色，可能含黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇等黄酮类化合物。取样品液5mL，加入少许镁粉振摇，滴加数滴浓盐酸，微热2min。并作空白对照实验（在样品液中仅加入浓盐酸进行观察）。可观察到在用粗提取液进行预试时，加入浓盐酸后升起的泡沫颜色呈紫红色，溶液显橙红色，表明样品液中有黄酮类物质存在。橙红色：黄酮类化合物。取自制的黄酮样品少许置于试管中，加5%vol的乙醇2mL，在水浴中加热溶解，滴加2滴浓HC1，再加镁粉约50mg，即产生剧烈的反应。反应过程中溶液颜色逐渐由黄色变为橙红色。此现象表明被测物为黄酮类物质。12.3、四氢硼钠反应取8支试管，分别加入少许经
