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1、第四章 食用菌菌种生产俗话说：“母壮儿肥”，好种是保证丰产、丰收的基础。第一节食用菌菌种概述 一、菌种的概念 指人工培养进行扩大繁殖和用于生产的纯菌丝体。二、菌种重要性菌种：食用菌生产中的“种子”，菌种质量的好坏直接影响栽培的成败和产量的高低，只有优良的菌种才能获得高产和优质的产品，因此生产优良的菌种是食用菌栽培的一个极其重要的环节。 二、菌种的类型 根据菌种的来源、繁殖代数及生产目的，把菌种分为母钟、原种和栽培种 1、母种：从孢子分离培养或组织分离培养获得的纯菌丝体。生产上用的母种实际上是再生母种，又称一级菌种。母种既可繁殖原种，又适于菌种保藏。2、原种：将线种在无菌的条件下移接到粪草、木屑
2、、棉籽壳或谷粒等固体培养基一培养的菌种。又称二级菌种或瓶装菌种。原种主要用于菌种的扩大培养，有时也可以直接出菇3、栽培种：将二级种转接到相同或相似的培养基上进行扩大培育，用于生产上的菌种。又称三级菌种或袋装菌种。栽培种一般不用于再扩大繁殖菌种。5第二节 食用菌制种的条件 一、食用菌制种程序 食用菌生产就是指在严格的无菌条件下大量培养繁殖菌种的过程，一般食用菌制种都需要经过母种、原种和栽培种三个培养步骤。 菌种生产流程菌种母种原种栽培种又称一级种、试管种、斜面种二级种、瓶装种三级种、袋装种、生产种培养容器试管菌种瓶塑料袋、菌种瓶培养基斜面固体固体数量少不多多转接1支?30支（再生母种）1支再生母
3、种?8瓶1瓶?20袋（瓶）二、制种设备和条件（一）机械设备1、原料加工设备枝材切片机、木片粉碎机2、拌料分装设备搅拌机、装瓶机or装袋机（二）灭菌设备1、灭菌设备高压灭菌锅、常压灭菌灶2、消毒条件药剂、紫外灯、电子灭菌器等（三）接种设备1、接种条件接种室无菌室，4-8m2，缓冲间，紫外灯2、接种设备超净工作台or接种箱、接种工具、酒精灯（四）培养设备1、培养条件菌种培养室2、培养设备恒温培养箱（五）保藏设备1、冰箱冷藏室2、冷藏恒温库5第三节 食用菌菌种培养基一、培养基 就是采用人工的方法，按照一定比例配制各种营养物质以供给食用菌生长繁殖的基质。培养基必须具备三个条件：第一：含有该菌生长发育所
4、需的营养物质。第二：具有一定的生长环境。第三：必须经过严格的灭菌，保持无菌状态。（一）物理状态 1、液体培养基：是指把食用菌生长发育所需的营养物质按一定比例加水配制而成的液体培养基。营养成分分布均匀，有利于食用菌充分接触和吸收养料，因而菌丝体生长迅速而粗壮，同时这种液体菌种便于接种工作的机械化、自动化，有利于提高生产效率。 缺点：是要发酵设备，成本较高，也较复杂。液体培养基常用来观察菌种的培养特征以及检查菌种的污染情况。用途：实验室，用于生理生化方面的研究；生产上，用于培养液体菌种或生产菌丝体及其代谢产物。 2、固体培养基：是以含有纤维素、木质素、淀粉等各种碳源物质为主，添加适量有机氮源、无机
5、盐等，含有一定水分呈现固体状态的培养基。优点：原料来源广泛，价格低廉，配制容易，营养丰富。缺点：菌丝体生长较慢。用途：是食用菌原种和栽培种的主要培养基。 3、固化培养基：是指将各种营养物质按比例配制成营养液后，再加入适量的凝固剂，如2%左右的琼脂，加热至60以上是液体，冷却到40以下时则为固体。用途：主要用于母种的分离和保藏。（二）营养来源（1）天然培养基（利用天然来源的有机物配制而成。）（2）合成培养基（由各种纯化学物质按一定比例配制而成。）（3）半合成培养基（由部分纯化学物质和部分天然物质配制而成。）（三）表面形式 （1）斜面培养基（2）平面培养基（3）高层培养基（四）用途（1）母种培养基
6、（2）原种培养基（3）栽培种培养基二、母种常用培养基（一）母种培养基常用物质马铃薯、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、维生素B1等。马铃薯葡萄糖磷酸二氢钾硫酸镁琼脂 （二）常见的母种培养基 1、马铃薯葡萄糖培养基（PDA培养基）：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18-20g、水1000ml。 2、马铃薯综合培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、琼脂18-20g、维生素B110mg、水1000ml。 3、木屑浸出汁培养基4、棉籽壳煮汁培养基5、豆芽汁培养基等等 （三）母种斜面培养基的制作1、称取用天平称取培养基各种成分的用量。2、配制溶液为避免发生沉淀，加入的顺
7、序一般是先加缓冲化合物，溶解后加入主要元素，然后是微量元素，再加入维生素等。最好是每种成分溶解后，再加入第二种营养成分。若各种成分均不发生沉淀，也可以一起加入。若用马铃薯、玉米粉、苹果、米粉、木屑等原料时，应先制取这些原料的煮汁，然后再把煮汁与其它成分混合。例如：PDA培养基的配制把选好的马铃薯洗净，去皮挖去芽眼，切成薄片或1厘米大小的方块，称取200克放在容器中，加水1000毫升，加热煮沸2030分钟，至软而不烂的程度，用四层纱布过滤；取其滤液。在滤液中加入琼脂，小火加热，用玻璃棒不断搅拌，以防溢出或焦底，至琼脂全部溶化，再加入葡萄糖使其溶化，最后加水至1000毫升即成。3、调pH一般用10
8、HCl或10NaOH调pH，用pH试纸（或pH计）进行测试。4、分装培养基配制好后，趁热倒入大的玻璃漏斗中，打开弹簧夹，按需要分装于试管或三角瓶内。注意事项：（1）将漏斗导管插入试管中下部，以防培养基沾在管口或瓶口。（2）分装体积：以试管总长的1/41/5为宜，三角瓶容量1/3为宜。5、塞棉塞这样既可过滤空气，避免杂菌侵入，又可减缓培养基水分的蒸发。制棉塞的方法多种，形状各异，总原则如下：（1）用普通棉花制作。（2）松紧适合。（3）塞头不要太大，一般为球状。（1）制作斜面培养基。一般斜面长度达试管长度的1/22/3为宜，待冷却后即成斜面培养基。（2）制作平板培养基。灭菌的三角瓶中的培养基，倒入
9、无菌培养皿中（每皿倒入1520毫升），凝固后即成平板培养基。8、无菌检查取数支斜面培养基放人28左右的恒温箱中培养23天，若无杂菌生长便可使用。若暂时用不完，用纸包好放人4冰箱保存。6、灭菌将包扎好的试管直立放人手提高压灭菌锅内，盖上牛皮纸，在1.05kg/cm2压力下，灭菌30分钟。7、摆斜面灭菌后冷却到60左右，从锅内取出，趁热摆成斜面。（1）制作斜面培养基。一般斜面长度达试管长度的1/22/3为宜，待冷却后即成斜面培养基。（2）制作平板培养基。灭菌的三角瓶中的培养基，倒入无菌培养皿中（每皿倒入1520毫升），凝固后即成平板培养基。8、无菌检查取数支斜面培养基放人28左右的恒温箱中培养23
10、天，若无杂菌生长便可使用。若暂时用不完，用纸包好放人4冰箱保存。三、原种和栽培种常用的培养基（一）常用的培养基P421、棉籽壳培养基棉籽壳98%、蔗糖1%、石膏粉1%、加水调至65%左右。2、木屑培养基木屑78%、米糠或麸皮20%、蔗糖1%、石膏粉1%、加水调至50%60%左右。3、棉籽壳麦麸培养基4、棉籽壳木屑培养基（二）培养基的制作1、称料 先称主料，再称辅料2、拌料3、调pH4、分装培养料5、清洁瓶、袋外壁。6、封口7、灭菌5第四节 食用菌菌种分离一、菌种分离方法组织分离法（最常用的方法）孢子分离法（不常用的方法）基质分离法（没办法的办法）（一）组织分离法1、概念将食用菌的部分组织移接到
11、斜面培养基上获得纯培养的方法。部分组织：子实体或菌核、菌索的任何一部分组织2、特点：属于无性繁殖，能保持原有菌株的优良种性。方法简单易行，适用于所有伞菌及猴头菌。若种菇感染病毒，不易脱毒。（1）子实体组织分离法：他是采用子实体的任何一部分如菌盖、菌柄、菌褶、菌肉进行组织培养，而形成菌丝体的方法。尽管子实体的任何一部分都能分离培养出菌种，但是多年的实践经验表明，选用菌柄和菌褶交接处的菌肉最好。子实体组织分离的方法和步骤：种菇的选择-种菇的消毒-切块接种-培养纯化-出菇试验母种操作过程（以伞菌类为例）：种菇选择：选择头潮菇、外观典型、大小适中、菌肉肥厚、颜色正常、尚未散孢、无病虫害、长至七八分成熟
12、的优质单朵菇作种菇。种菇消毒：0.1%升汞溶液或75%酒精，浸泡或擦拭，无菌水冲洗，吸干表面的水分。切块接种：将分离种菇沿柄中心纵向掰成两半，用解剖刀在菇盖柄交接处划成田字形，取黄豆大一小块菌肉组织，接在斜面培养基上。培养纯化：在25下，培养24d长出白色绒毛状菌丝体，当菌丝延伸到基质上后，用接种针挑取菌丝顶端部分，接种到新的斜面培养基上，长满管后即为母种。（2）菌核组织分离法：它是从食用菌菌核分离培养获得纯菌丝的一种方法。如猪苓、茯苓、雷丸等食用兼药用菌。（3）菌索组织分离法：它是从食用菌菌索种分离培养得到纯菌丝的方法。如蜜环菌、假蜜环菌等食用菌。（二）孢子分离法1、概念利用子实体产生的成熟
13、有性孢子分离培养获得纯菌种的方法。2、特点（1）属于有性繁殖，后代易发生变异，可用此法培育新品种。（2）分离过程较复杂，适用于胶质菌类和小型伞菌。3、操作过程种菇选择种菇消毒采集孢子接种培养挑菌落纯化菌种母种4、几种方法（1）单孢子分离法用于杂交，选育新的优质菌种。平板稀释法连续稀释法（2）孢子印分离法取成热子实体经表面消毒后，切去菌柄，将菌褶向下放置于灭过菌的有色纸上，在2024静置一天，大量孢子落下形成孢子印，然后移少量孢子在试管培养基上培养。（3）孢子弹射分离法悬钩法剪取一小块新鲜的耳片组织，悬挂在盛有培养基的三角瓶的棉花塞下方或培养皿的上盖内面，放在25温箱中或室温下，23天后，耳片上
14、的担孢子会弹射到下面的培养基表面，萌发后形成胶质菌落。2、孢子分离法：是用食用菌成熟的有形孢子萌发培养成菌丝体而得到菌种的方法。（三）基质分离法（菇木分离法）1、概念从生长子实体的培养基中分离菌丝获得纯培养的方法。2、特点（1）污染率高。（2）子实体已腐烂，但又必须保留该种菌种。（3）有些子实体小而薄，用组织分离法和孢子分离法较困难。（4）还有一些菌类如银耳菌丝，只有与香灰菌丝生长在一起才能产生子实体，如果要同时得到这两种菌丝的混合种，也只能采用基内菌丝分离法进行分离。3、操作过程菇木选择菇木消毒切块接种培养纯化母种二、菌种分离提纯1、选择性培养基抗霉培养基：涕必灵（TBZ）或多菌灵（MBC）培养基抗菌素：四环素、氯霉素、链霉素、金霉素等。2、排除细菌性污染利用某些大型真菌在温度较低（2025）时，菌丝生长比细菌要快的特点，用接种针切割菌丝的前端，接种到斜面培养基上（无冷凝水、硬度高），连续23次就能获得纯菌丝。3、排除霉菌污染切割法、基内菌丝挑取法4、菌丝再提纯三、出菇试验包括菌丝生长速度、吃料能力、菌丝形态特征、生理生态特性、出菇速度、菇体形态特征、产量、质量等。5第五节 食用菌菌种的扩繁与培养引言：从外地购进或分离获得的母种数量有限，不能满足生产的
