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1、专业课程论文题 目:单克隆抗体综述及其行业发展动态分析 姓 名: 徐梦佳 学 院: 食品科技学院 专 业: 生物工程 班 级: 102班 学 号: 18410221 指导教师: 王晓晴 2013 年 3 月 20 日单克隆抗体综述及其行业发展动态分析摘要：单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具，它可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系;生产出针对复杂生物混合物中的特定分子的抗体,可用于分离、分析及纯化该特定分子抗原;其试剂可用于临床诊断和治疗,或用于以单抗为弹头的“生物导弹”药物等。近年来，随着分子生物学和细胞生物学的发展，出现了嵌合抗体制备技术、噬菌体展示技术、核糖体展示技
2、术等，这些技术有效地解决了单克隆抗体鼠源性等问题，还有DNA免疫制备抗体的研究进展，使单克隆抗体凭借自身高度特异性和均一性的特点在治疗肿瘤、自身免疫性疾病和器官移植等方面显出了独特的优势和良好的应用前景，故单克隆抗体制备技术的发展也就显得尤为重要。1975年,Kohler和Milstein创立了杂交瘤技术制备单克隆抗体( monoclonal antibody，McAb)，所谓 McAb 是利用 HAT 培养基筛选出既能稳定生长又能产生抗体的杂交瘤细胞，杂交瘤细胞分泌的抗体是由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的具有高度特异性和均一性的抗体，故称之为 McAb。单克隆抗体技术自问世以来,在临床
3、治疗方面进展缓慢,，主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的,而鼠源单抗应用于人体治疗时存在诸多问题:一方面，鼠源单抗与自然杀伤细胞等免疫细胞表面 Fc 段受体亲和力弱，产生的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用较弱，对肿瘤细胞的杀伤能力较弱，人血循环中的半衰期短，它发挥细胞毒作用作用的时间较短; 另一方面，鼠 McAb 还具有免疫原性，产生人抗鼠抗体，既降低单抗的治疗效果，又诱发变态反应。因此,在保持对特异抗原表位的高亲和力的基础上人源化和全人化的改造,减少异源抗体的免疫原性成为单抗研究的重点。此外,传统杂交瘤技术还存在制备周期较长,成本较高,杂交瘤细胞不稳定抗性会丢失等缺陷。要解决传统杂交瘤技术所
4、存在的问题,为单克隆抗体的应用提供更广阔的空间，出现了嵌合抗体制备技术、噬菌体展示技术、核糖体展示技术、DNA免疫制备抗体技术，制备单克隆抗体。自然杂志预测，2012年全球销售额前10名的药物中有6个为抗体药物并占据销售额最大的前3位。全球范围内单抗药产业的布局是不平衡的，其中欧美研发实力最强，产品线丰富，而属于新生力量的中国正大力发展单抗药物，努力提供单抗药物产品线。此外，前景广阔的单抗药物受到药企的青睐，很多跨国药企通过收购技术平台涉足这一领域，罗氏是这个领域内典型的例子，其收购的基因泰克公司是单抗药物行业的全球领跑者。 全球生物制药产业正处于快速上升期，其中单克隆抗体药物最为活跃，相比2
5、010年的480亿美元，2011年全球单抗药物的市场总量已经达到628亿美元，增速为30.8 %。抗体市场是从2000年之后开始蓬勃兴起的，2000-2008年间单抗药物复合增长率达到 41%。中国行业研究网发布的2012-2016年中国单克隆抗体行业投资分析及深度研究咨询报告显示：未来，全球单克隆抗体药依旧会保持较高的增长率。到2015年，全球单克隆抗体药销售额有望达980亿美元左右。一单克隆抗体综述1.嵌合抗体制备技术 11人-鼠嵌合抗体制备技术 该技术产生于1980年代中期,是应用DNA重组技术将人 McAb 的恒定区基因替换鼠 McAb 的恒定区基因，从而编码产生的 McAb。1980
6、年代中后期,科学家对嵌合抗体进一步改进后,抗体基因只有互补性决定区(CDR)是鼠源成分,其余均为人基因序列,1.1.1 技术原理即将鼠源性单抗在保留其抗原结合活性的基础上，尽可能去除鼠源化部分或代之以人源化片段，从而尽可能减少单抗的异源性，然后根据所用的载体质粒标记基因产物,选用适当的抗生素或试剂进行筛选,再用与传统杂交瘤技术相似的方法克隆出分泌人鼠嵌合抗体的细胞株。1.1.2 技术优缺点嵌合抗体不但具有与鼠源单抗相同的特异性、亲和力和产量,而且可根据不同的需要接上不同亚类的人恒定区基因来改变抗体的功能,使用更加灵活。然而，尽管尽力降低鼠源成分，这实现了抗体的高度人源化,但仍可诱发排异反应,并
7、未完全解决鼠抗体的免疫原性问题,而且人源化过程繁复且费用昂贵,大量的反复试验不可避免。因此又发展出了产生全人单克隆抗体的技术。12 人源化抗体制备技术 人源化改造主要是重构抗体和表面重塑抗体。1.2.1 技术原理抗体上，并不是整个 CDR 都参与抗原的特异性识别，在 CDR 区中仅一部分氨基酸残基与抗原结合，这些氨基酸残基决定抗体的特异性，被称之 SDR。SDR 移植抗体仅将异源抗体 CDR 区内与抗原结合关系密切的 SDR，移植到人抗体相应位置上，使人源化抗体的免疫原性进一步降低。1.2.2 缺点及改进方法SDR 移植抗体往往存在亲和力和特异性降低的缺点。目前重构抗体是对鼠源性单抗人源化改造
8、最常用、最基本的方法。表面重塑抗体是对鼠抗体框架区表面氨基酸的残基进行重塑或替换，该技术仅改造或替换与人抗体有明显差异的表面氨基酸的残基。在维持抗体活性和减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸残基替换，使抗体与抗原结合具有更好的亲和力和特异性。2噬菌体抗体库技术 噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术。2.1 技术原理它是一种基因表达产物和亲和选择相结合的技术，建立在噬菌体外壳具有表达抗体蛋白片段能力的基础上，以改构的噬菌体为载体，用基因工程技术克隆人抗体可变区的全套基因,然后将克隆的基因插入噬菌体编码衣壳蛋白的基因中,这样在噬菌体表面表达特定抗体片段,而在噬菌体核
9、心DNA中则含有该抗体片段的基因，建立了噬菌体抗体文库，形成获得一个具有上亿个体外方式制得的不同抗体的基因数据库。2.2 制备方法抗体的具体制备方法是将抗原包被在固定介质上,加入待筛选的噬菌体颗粒与固定的抗原结合,获取结合的抗体,将未结合的抗体洗脱,从噬菌体库中筛选出针对特定抗原的特异性抗体的可变区。用表达有相应抗体分子的噬菌体颗粒去感染宿主菌,使该噬菌体颗粒得到扩增。将抗体可变区与恒定区组合得到具有完整能的全人单克隆抗体。2.3 技术优点噬菌体展示技术的最大优点是一旦噬菌体库建立后,就可以根据需要直接从文库中筛选得到针对目标抗原的特异性抗体,大大缩短了单克隆抗体的制备周期并且得到的抗体可用于
10、制备完全人源化抗体。当抗体分离出来时,噬菌体系统同时也提供了设计抗体亲和性及其应用的模式。2.4 技术缺点但是该技术也存在一定的缺陷,由于受表达系统的限制,抗体库的库容不足以支持获得稀有的抗体,难以涵盖一些动物抗体的多样性; 而且对噬菌体或表达宿主的生长或功能产生抑制作用的抗体也难以获得，非免疫抗体库获得的抗体亲和力不高; 在淘选过程中会出现高 亲和力低拷贝的特异性噬菌体抗体的丢失等。3 核糖体展示技术 核糖体展示技术是一种完全在体外合成并筛选蛋白质的无细胞转化技术。3.1 技术原理该技术建立不受细胞转染和表达等因素影响的完全体外展示系统，利用聚合酶链反应扩增含目的基因的 cDNA 文库，同时
11、引入启动子、核糖体结合位点及茎环结构，在转录/翻译耦联系统作用下，形成“蛋白质-核糖体-mRNA”三元复合物，构成核糖体展示的抗体库，再用相应的抗原对翻译混合物进行筛选并从中分离 mRNA，通过反转录-聚合酶链反应富集目的基因，并将目的基因导入表达载体，从而获得库容量大、特异性强、亲和力高的人源基因工程抗体库。核糖体展示系统的抗体筛选过程与噬菌体展示系统的过程相类似。3.2 技术优点核糖体展示技术的主要优点是一方面能产生更大的抗体库,库容可达到1015 ,另一方面可以方便地与一些特殊的PCR技术,如性别PCR、错配PCR等结合,获得更多的抗体遗传多样性,而且所表达的抗体具有正确的空间折叠构象。
12、核糖体展示技术已经成功地用于生产抗黄体酮的抗体片段。4 DNA免疫制备抗体技术DNA免疫是近年发展起来的一种新型抗体制备法。DNA免疫克服了传统蛋白质免疫方法的缺陷，能更为有效地激发机体的体液和细胞免疫应答，为某些疾病如病毒性疾病和肿瘤等的诊断和免疫治疗开拓了新的途径。4.1 技术原理 现代免疫学研究表明，机体对抗原的应答取决于两个要素:抗原的免疫原性;机体对抗原的递呈及相应的反应性。在抗原的免疫原性无法改变的情况下，可提高机体对相应抗原的反应性。目前DNA免疫的焦点是抗原的递呈机制及佐剂对DNA免疫的影响。虽然DNA免疫后在体内如何被细胞摄取及其表达的抗原又如何被递呈尚未完全清楚，但许多文献
13、均证实了肌细胞对DNA的摄取及抗原蛋白的表达起到很重要的作用。由皮肤和肌肉途径给予DNA均可产生体液免疫应答和细胞免疫应答。4.2 具体方法一般选用5一8周龄的BALB/C雌性小鼠，免疫6周龄以下小鼠可获得更好的免疫应答，免疫4周龄小鼠特异性蛋白质表达水平最高。Webster等认为在DNA免疫中最有效的方法和途径是用基因枪在肌肉或皮内免疫DNA包被的金颗粒。但有人把DNA直接注射至小鼠的股四头肌也能很好地激发机体的免疫应答。通过这两种免疫方法制备的单克隆抗体均能被DNA编码的蛋白识别。还有人发现肌肉注射DNA的特异性蛋白质表达效率明显高于静脉注射DNA，经皮内注射和肌肉注射等量DNA，发现肌肉
14、免疫的方法产生特异性抗体和CTL的效率高，因而肌肉注射方法最佳。4.3 技术优点DNA免疫较常规免疫产生的体液免疫应答强而持久，因此用DNA免疫制备单克隆抗体和多克隆抗体可以省时省力。DNA肌肉注射后，被肌细胞摄取的DNA半衰期延长，蛋白质持续表达，并且加强了B细胞和T细胞的记忆持久性。DNA免疫可用于已知DNA编码而又不能得到目的蛋白或获得的抗原蛋白为低免疫原性抗原的免疫，也可用于大动物免疫如兔、猪等。为特异性强、纯度高的单克隆抗体的制备提供了一个省时省力的好方法。4.4 技术存在缺点大部分DNA被核酸酶降解，解决DNA在动物体内的稳定性是DNA免疫的关键;DNA疫较蛋白质免疫引起的免疫应答
15、较迟，这可能与DNA免疫后需经过特异性蛋白质的表达才能激发机体的免疫应答有关;DNA免疫是否还诱导动物产生特异性免疫耐受还有待于深入的探讨。4.5 技术应用前景随着DNA免疫技术的发展，能免疫除多糖类抗原外所有已知DNA编码的蛋白质抗原，如病毒蛋白、免疫球蛋白、肿瘤抗原等闭。DNA免疫不仅在无法获得纯化蛋白质的情况下开拓了研制特异性抗体的新途径，而且逾越了抗原的低免疫原性的障碍，有效地激发宿主的特异性免疫应答。同时DNA免疫激发机体产生强而持久的体液免疫，这为高产量特异性多克隆抗体和纯度高、特异性强的单克隆抗体的获得提供了必要条件，在许多疾病如病毒性疾病和肿瘤等诊断和免疫治疗中具有良好的应用前景。二中国单克隆抗体药物市场应用状况态势分析1.中国单克隆抗体在治疗癌症、肿瘤上的研究和发展中国癌症、肿瘤发病及死亡
