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1、丙泊酚及右美托咪定对体外培养海马神经元的影响及机制研究第一部分原代乳鼠海马神经元的培养、形态学观察及纯度鉴定目的:1培养新生SD乳鼠海马神经元,掌握大鼠海马神经元的体外培养技术;2观察不同阶段的原代海马神经元的形态学特点;3利用免疫荧光细胞化学方法鉴定神经元纯度。方法:取新生24 h内的SD乳鼠,用碘酊和75%乙醇消毒,剪断头,分层剪开皮肤和颅骨,用弯镊取出大脑,置于预冷的DMEM液中,快速剥离出两侧海马组织,在解剖显微镜下去除海马的血管和被膜,把海马移入含有木瓜酶的DMEM中,置于37C,5%CO2培养箱中消化30 min。用吸管将组织块移入含有10%血清的DMEM液中终止消化2 min。然
2、后把组织块移入含有血清的DMEM液中,用维纳斯剪剪碎,用枪头轻轻吹打三到五次,然后过200目细胞筛。取0.9 ml按台盼蓝拒染法进行活细胞计数,制成1106/ml密度的细胞悬液,种植于Matrigel基膜包被的24孔培养板中,每孔加500l,置于37C,5%CO2的培养箱内培养。6 h后全量换无血清Neurobasal培养基。第48 h时加入终浓度为10mol/L的阿糖胞苷,以抑制非神经元细胞的过度生长。每2天半量换液,并在显微镜下观察神经元的生长情况。神经元培养6 d后,应用免疫荧光化学技术,用不同的荧光标记分别显示神经元和星形胶质细胞。荧光显微镜下观察,拍照。随机选取3个孔,在高倍视野(1
3、020倍)下随机选取3个视野,计数神经元、星形胶质细胞及所有细胞核的数目,计算神经元所占的百分比,取均值作为每孔神经元纯度。结果:1体外培养的原代SD乳鼠海马神经元,形态典型,突起连接成网,生长状态良好;2体外培养的原代海马神经元细胞核染色清晰,海马神经元纯度为(94.811.90)%,组间差异无统计学意义(P=0.81)。结论:体外培养的原代SD新生乳鼠海马神经元形态典型,纯度在90%以上,能够满足进一步的实验要求。第二部分丙泊酚及右美托咪定对发育期海马神经元突起及突触影响目的:探讨丙泊酚及右美托咪定是否会对原代培养的发育期SD乳鼠海马神经元突起及突触的发育产生影响。方法:取原代培养第6 d
4、的海马神经元,随机分为5组:空白对照组(C组)、丙泊酚溶剂对照组(F组)、丙泊酚组(P组)、右美托咪定组(D组)、丙泊酚加右美托咪定组(PD组)。于培养第6天,P组加入丙泊酚,使其终浓度为100mol/L;F组加入等体积的丙泊酚溶剂;D组加入生理盐水稀释的右美托咪定,使其终浓度为100 nmol/L,PD组加入右美托咪定和丙泊酚,使其终浓度分别为100 nmol/L和100mol/L;C组加入等体积的生理盐水。继续培养8h后,为各组神经元全量换液,并用PBS清洗2次,加入培养基继续培养24h,随机选取视野为神经元拍照。所得照片用Motic Med 6.0软件处理,使用其测量长度工具测量视野内轴
5、突和树突的总长度,计数该视野神经元总数,以该视野神经元平均突起总长度作为统计指标。用免疫荧光化学法测定各组神经元突触素的含量,采集突触素荧光图像,用Image-Pro Plus 6.0软件分析各组突触素的平均荧光密度(MOD,mean optical density)。结果:1神经元平均突起总长度:P组及PD组与C组比较,数值有所降低,差异有统计学意义(P<0.05);PD组与P组比较,数值有所升高,差异有统计学意义(P<0.05);F组及D组与C组比较,差异无统计学意义。2突触素的平均荧光密度值(MOD):P组及PD组与C组比较,数值有所降低,差异有统计学意义(P<0.05
6、);PD组与P组比较,数值有所升高,差异有统计学意义(P<0.05);F组及D组与C组比较,差异无统计学意义。结论:1丙泊酚影响原代培养的乳鼠海马神经元突起及突触的发育;2右美托咪定减少丙泊酚对原代培养乳鼠海马神经元突起及突触发育的影响。第三部分丙泊酚及右美托咪定对发育期海马神经元影响的可能机制目的:探讨丙泊酚及右美托咪定对发育期海马神经元影响的可能分子机制。方法:取原代培养第6 d的海马神经元,随机分为6组:空白对照组(C组)、丙泊酚溶剂对照组(F组)、丙泊酚组(P组)、右美托咪定组(D组)、丙泊酚加右美托咪定组(PD组)、育亨宾组(Y组)。于培养第5天,P组加入丙泊酚,使其终浓度为1
7、00mol/L;F组加入等体积的丙泊酚溶剂;D组加入生理盐水稀释的右美托咪定,使其终浓度为100 nmol/L,PD组加入右美托咪定和丙泊酚,使其终浓度分别为100 nmol/L和100mol/L;Y组先加入育亨宾,使其终浓度为2mol/L,再加入右美托咪定和丙泊酚,终浓度同PD组;C组加入等体积的生理盐水。继续培养8h后,为各组神经元全量换液,并用PBS清洗2次,加入培养基继续培养24h,弃去培养基,用PBS清洗两次,收集每组细胞,利用Western Blot技术分析各组脑源性神经营养因子(BDNF,brain-derived neurotrophic factor)及其特异性受体Trk B
8、和坍塌反应调节蛋白2(CRMP-2,collapsin response mediator protein-2)表达的改变。利用Gel Image Analysis V 2.02软件分析各条带的灰度值,BDNF,Trk B和CRMP-2蛋白的相对量分别以BDNF,Trk B和CRMP-2条带的灰度值与内参-actin条带灰度值的比值表示。结果:1 BDNF:P组及PD组与C组比较,数值有所降低,差异有统计学意义(P<0.05);PD组与P组比较,数值有所升高,差异有统计学意义(P<0.05);Y组与P组比较,数值有所降低,差异有统计学意义(P<0.05);F组及D组与C组比较
9、,差异无统计学意义。2 Trk B:P组、PD组及D组与C组比较,数值有所降低,差异有统计学意义(P<0.05);PD组及D组与P组比较,数值有所升高,差异有统计学意义(P<0.05);Y组与P组比较,数值有所降低,差异有统计学意义(P<0.05);F组与C组比较,差异无统计学意义。3 CRMP-2:P组及PD组与C组比较,数值有所降低,差异有统计学意义(P<0.05);与P组比较,PD组、Y组数值有所升高,差异有统计学意义(P<0.05);F组及D组与C组比较,差异无统计学意义。结论:1丙泊酚减少体外培养海马神经元BDNF,Trk B和CRMP-2的表达可能是丙泊酚影响海马神经元突起及突触发育的分子机制之一;2右美托咪定使丙泊酚孵育的体外培养海马神经元中BDNF,Trk B和CRMP-2的表达增加,可能是右美托咪定能减少丙泊酚对体外培养海马神经元突起及突触发育影响的可能分子机制之一。
