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1、实验五 果蝇唾液腺染色体的观察及制备一、目的1掌握剖离果蝇幼虫唾液腺的技术。2掌握制作果蝇唾液腺染色体玻片标本的方法。3观察果蝇唾液腺染色体的形态特征。4.了解体细胞染色体联会现象。二、原理1.双翅目昆虫（摇蚊、果蝇等）幼虫期的唾液腺细胞巨大，其中的染色体称为唾液染色体（salivary chromosome）。这种染色体比普通染色体大的多，宽约5m,长约400m，相当于普通染色体的100150倍，因而又称为巨型染色体。唾液腺染色体经过多次复制而不分开，大约有1 0004 000根染色体丝的拷贝，所以又称多线染色体（polytene chromosome）。多线染色体染色后，出现深浅不同、疏密
2、各别的横纹，这些横纹的数目和位置往往是恒定的，代表着果蝇等昆虫的很多特征。例如染色体有缺失、重复、到位、易位等，很容易在唾液腺染色体上识别。2.黑复果蝇的唾液腺染色体是2n=2*4=8(图一)，但因体细胞配对，又因短小的第4染色体和X染色体的着丝粒在端部所以染色体的一端在染色中心上，看上去，各自只形成一条线状和点状染色体。只有第2和第3染色体的着丝粒在中央，它们从染色中心以V字形向外伸出（2L，2R，3L，3R），因此共有6条（图二）图一图二在显微镜下，短小的第4染色体有时不易观察到，所以最容易识别的是第5（图三）雄果蝇的Y染色体几乎包含在染色中心里，因为是异染色质，看起来很淡。唾液染色体上的
3、横纹宽窄、浓淡是一定的，但在果蝇的特定发育时期，它们会出现的膨胀，这称为疏松区（puff），目前人们认为这是这部分基因被激活的标志。图三3.唾液腺染色体的另一特点是体细胞中同源染色体处于紧密配对状态，这种状态称为“体细胞联会”。在以后不断的复制中仍不分开，由此成千上万条核蛋白纤维丝唾液腺染色体（salivary gland chromosome）是一类存在于双翅目昆虫，如果结合在一起，紧密盘绕。所以细胞中染色体只呈单倍数。黑腹果蝇的染色体数目2n=8其中第、第染色体为中部着丝粒染色体，第染色体和第IX染色体为端着丝粒染色体。唾液腺染色体形成时，染色体着丝粒和近着丝粒的异染色质区聚于一起形成一个
4、染色中心（chromo-center），所以在光学显微镜下可见从染色中心处伸出6条配对的染色体臂，其中5条为长臂，l条为紧靠染色中心的很短的臂。唾液腺染色体经染色后，呈现深浅不同，疏密各异的横纹（band）。这些横纹的数目，位置，宽窄及排列顺序都具有物种的特异性。研究认为这些横纹与染色体的基因是有一定关系的。通过一定的实验方法使果蝇唾液腺染色体各臂分散开，并且使带纹、膨突等特征不受杂质影响清晰地显示出来，是进行果蝇遗传学研究的很重要的一个环节果蝇唾液腺染色体在不同种间的共同点是染色体的着丝点位于一个染色区域，但不同的种类往往其染色体臂数目不同每条染色体臂上分布着染色深浅不同、粗细各异的磺纹(b
5、and)， 这些横纹的宽窄疏密程度以及排列顺序和数目又都有种的特异性和种内的差异由此，果蝇唾液腺染色体近几十年来， 已广泛用于种内系统发生和种间亲缘关系的研究中， 因为种间及种内不同品系和近缘种中的遗传差异经常反映在唾液腺染色体的不联会、形成泡(puff)、缢虞(constriction)和间带区的伸缩性以及顶体(telomere)的形态等多方面的差异，而特别重要的是研究它的基因序列的差异(观察是否产生了例位以及染色体的断裂、融合和重排) 因此，无论从细胞遗传学的角度研究基因与突变性状之间的联系，还是从进化遗传遗传学方面研究染色体的系统发生，探讨种间以及近缘种间的遗传差异和生殖隔离的机制等，唾
6、液腺染色体的分析研究都是十分重要的从其横纹分布特征可对物种的进化特征进行比较分析，而一旦染色体上发生了缺失，重复，倒位。易位等结构变化，也可较容易地在唾液腺染色体上观察识别出来。三、仪器设备及材料，试济仪器设备：解剖镜，显微镜，恒温培养箱，镊子，解剖针，载玻片及盖玻片，吸水纸解剖镜，显微镜，恒温培养箱，镊子，解剖针，载玻片及盖玻片。材料:黑腹果蝇（Drosophila melanogaster ）三龄幼虫（选择行动迟缓、肥大、爬在管壁上既将化蛹的三龄幼虫，利用这样的唾液腺细胞才能制备出理想的染色玻片标本）（图四）（图四）试剂：醋酸洋红液，蒸溜水，浓盐酸，Ephrussi-beaclle生理盐水
7、四、实验步骤（一）材料准备：在一干净载玻片上滴一滴生理盐水，选择行动迟缓、肥大、爬在管壁上即将化蛹的三龄幼虫放于生理盐水中 （二）剥离唾腺：在解剖镜下左手持解剖针按压住幼虫后端13处。固定幼虫，右手持解剖针扎住幼虫头部口器处，适当用力向后拉，把头部与身体拉开，唾液腺腺体随之而出，再用解剖针先将含有腺体的一团组织与其它组织分开然后再将腺体与脂肪等组织分开得到果蝇唾液腺。（果蝇的唾液腺是位于口器后端神经节两侧的一对透明而微白的类似香蕉形的长形小囊，由单层细胞构成。细胞大，细胞核大，细胞轮廓清晰（图五） 脂肪体 唾液腺 （图五） (图六)（三）低渗处理：在载玻片上滴一滴低浓度的Nacl溶液对唾液腺处
8、理10-15min,使其细胞充分吸水而容易弄破。（四） 解离: 用滤纸吸取低浓度Nacl,再在载玻片上滴一滴lmolL HCI，让唾液腺在lmolL HCI中解离40-60分钟(!)，以松软组织，利于染色体分散。（五） 染色 ：解离后的腺体可用水冲洗2-3次后滴2滴品红染液染色20分钟。 (注：解剖和染色过程勿使腺体于燥，在酒精灯上加热以增强染色效果。可以不经解离一步而直接染色，也可以在将幼虫头部与身体拉开后马上加染液染色，然后慢慢剖离腺体)（六）压片： 当腺体被染成红色后，用滤纸擦去染液周围一圈的黑色沉淀物，再用蒸馏水冲洗23次，然后加上盖玻片，在盖玻片上方再植盖一层滤纸，再用拇指按住盖玻片
9、用力下压，把腺体细胞压破，把染色体压散开（注：压片时放载玻片的桌面要干，不要使盖片滑动。制好的玻片标本用蜡封住盖玻片四周以防干燥。经低温冷冻处理的材料经解离，染色加盖片后不必敲击镜检即可看到分散良好的染色体。）（七）镜检： 将制好的片子先用低倍显微镜观察。找到好的染色体于视野中心，再用高倍镜油镜观察。如果制片理想，可做成永久制片。注意事项: 1. 一定加生理盐水，否则唾腺易干。2. 水不可太多，否则幼虫会漂浮而且活跃。如水多了，请再剥离唾腺前吸走些，唾腺剥离后请勿吸水，以防将唾腺一起吸走。3. 清除脂肪组织时要量力而行。4. 染色液勿过多，否则压片时唾腺易随染色液漂走。如染色时间到后，染色液已
10、干，应再少加些染色液，再盖上盖波片，避免气泡产生。5. 压片时要均匀用力，轻敲盖片。五、实验结果：在显微镜下我们看到的结果如下结论:1.四对多线染色体的着丝粒区聚合成为一个，从此中心伸出5个长臂和个短臂。2.多线染色体中平行排列的染色质在各段凝缩紧密程度不同形成（85%呈带纹区深染，15%呈间带区浅染）。3.每一臂上所有的横纹的大小和位置是恒定的，即具有种的特征。 4.如染色体有缺失、重复、倒位、易位等，很容易在唾腺染色体上识别出来。六、思考与讨论1.何谓线染色体（你重新思考一下）答：1一种缆状的巨型染色体，见于有些生物生命周期的某些阶段里的某些细胞中。由核内有丝分裂产生的多股染色单体平行排列
11、而成。各染色单体上的染色粒（见灯刷染色体）并排排列，构成多线染色体的带，带与带之间则称间带。多线染色体的这种结构可用光学显微镜观察，也能在多线染色体上用原位分子杂交法进行基因定位，并就其结构与功能之间的关系进行系统研究，因此是细胞学和遗传学研究的有用材料。 核内DNA多次复制产生的子染色体平行排列, 且体细胞内同源染色体配对, 紧密结合在一起, 从而阻止了染色体纤维进一步聚缩, 形成体积很大的由多条染色体组成的结构叫多线染色体。多线化的细胞处于永久间期, 体积也相应增大, 它存在于双翅目昆虫的幼虫组织内, 如唾液腺、气管等。2.如何区别你看到的就是唾腺染色体？答：（1）由于在唾液腺细胞中8条染
12、色体之间以着丝粒互相连结在一起形成染色盘或异染中心和同源染色体之间的假联会，经碱性染料染色后，可以观察到一个染色较深的染色盘和以染色盘为中心向外辐射出的5条染色体臂。 (2)在这些染色体臂上可以看到染色深浅不同，被称做明带、暗带的横纹，这些横纹的位置，宽窄、数目都具有物种的特异性。不同物种，不同染色体的不同部位形态位置是固定的。因此根据染色体各条臂带纹特征和各条臂端部带纹特征能准确识别各条染色体。(3)在染色体臂上还可看到某些带纹通过染色体的解旋、膨大形成的疏松区和巴尔比尼氏环，其富含转录出来的RNA，因此不着色。（4）唾液腺细胞处于永久早期，染色体解旋呈伸展状态在幼虫发育过程中细胞核中的DN
13、A多次复制，但细胞、细胞核不分裂。复制后的染色单体DNA不分开，从而形成了多线染色体（5）每一臂上所有的横纹的大小和位置是恒定的，即具有种的特征。3.在昆虫学中，二龄幼虫，三龄幼虫有何生物学意义？（重新思考）答：果蝇是完全变态发育的生物之一，二龄幼虫，三龄幼虫是其变态发育的重要特点。从初生卵发育至新羽化的成虫为一个完整的发育周期，在25，60相对湿度条件下，大约为10天。通过控制养殖的温度，可以加速和减缓果蝇的发育。果蝇个体很小，幼虫在三龄时达到最大，约2毫米，成年果蝇也仅为23毫米。新羽化的雌性成虫大约8小时之后即可进行交配，交配之后大约40小时开始产卵，第4-5天出现产卵高峰。性成熟雌性果
14、蝇生殖能力很强，产卵初期每天可达5070枚，累计产卵可达上千枚。黑腹果蝇是最普遍应用于遗传学的果蝇，也是奠定经典遗传学基础的重要模式生物之一，对其染色体组成和表型、基因编码和定位的认识，是其它生物无法比拟的。基于清晰的遗传背景和便捷的遗传操作，果蝇在发育生物学、生物化学、分子生物学等领域也都占据了不可替代的位置。随着神经科学的兴起，许多遗传操作在该领域不断发展和成熟，为在果蝇中进行神经科学的研究打下了坚实的基础。总之，果蝇在近一个世纪以来的生物学舞台上占有举足轻重的地位，在各个领域的广泛应用使其成为一种理想的模式生物，不论在已往、现在和将来都将为人类探索生命科学的真谛做出不可磨灭的贡献。参考文献：图一、图二： http:/ 图三：http:/ 图五：余幼芳俞佩芳(华东师范大学生命科学学院上海200062) 生物学教学2007年(第32卷)第11图六：http:/202.207.208.44/jxzx/smkxyjzx/dmtkj/yc/%B9%FB%D3%AC%CD%D9%CF%D9%C8%BE%C9%AB%CC%E5%B5%C4%B9%DB%B2%EC.ppt#266,9,实验原理注意：每个图的标注方法按
