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1、地中海贫血相关基因检测试剂注册技术审查指导原则（） 附件3 地中海贫血相关基因检测试剂 注册技术审查指导原则 本指导原则旨在指导注册申请人对地中海贫血相关基因检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。 本指导原则是对地中海贫血相关基因检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，也不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但
2、需要提供详细的研究和验证资料，相关人员应在遵循法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。 一、适用范围 地中海贫血（简称地贫）是一种常染色体隐性遗传病，是由于珠蛋白基因发生突变（包括点突变和缺失等），致使珠蛋白肽链合成减少或完全不能合成而导致的一组单基因遗传性溶血性疾病，轻者可无临床表现，重者以进行性溶血性贫血为主要特征。根据珠蛋白肽链合成受到抑制的类型，地贫分为-，-和-地贫等，临床上最常见的是-和-地贫。地贫主要分布在地中海沿岸、东南亚和少数非洲地区，具有明显的
3、种族特性和地域分布差异。地贫是我国南方地区最常见、危害最大的遗传病之一，尤以广西、云南、广东、海南、四川和贵州等省份为甚，云南、海南和广东的地贫基因人群携带率可达10%以上，广西更是达到了20%以上。 -地贫主要是由于-珠蛋白基因发生突变而引起。-珠蛋白基因簇位于16p13.3，包括胎儿期和成人期表达的2个基因（2和1），基因的排列顺序为5-2-1-3。根据单倍型的情况，可将地贫分为3类：（1）缺失型+地贫（-/），缺失1个基因；（2）缺失型0地贫（-/），2个基因同时缺失；（3）非缺失型+地贫（T/或T/ ），1个1或2基因发生点突变或少数几个碱基的缺失。中国现已发现至少19种-珠蛋白基因大
4、片段缺失和38种-珠蛋白基因点突变。其中，6 种-珠蛋白基因的突变：-SEA/、-3.7/、-4.2/、WS/（HBA2：c.369Cgt;G）、QS/（HBA2：c.377 Tgt;C）；CS/（HBA2：c.427Tgt;C）占患病人群总数的98%。 -地贫基因型和临床分型的关系已经基本阐明。-地贫的表型严重程度随着功能性-珠蛋白基因的减少而加重：（1）1个-基因缺失或点突变（-/或T/或T/），称为静止型-地贫，通常不贫血，血液学表现为小细胞低色素；（2）2个-基因缺失或复合-基因点突变，或点突变，其基因型为-/或-/-或-/T或T/-或T/T，称为轻型-地贫，临床表现为不贫血或轻度贫血
5、，血液学检查有小细胞低色素特征；（3）3个-基因缺失或复合基因点突变，基因型为-/-或-/T，称为中间型-地贫，又称Hb H病，患者有轻至重度贫血。某些基因型为T/T的病例（如CS/CS、QS/QS和CS/QS）也表现为Hb H病。通常，-/T的非缺失型 Hb H病较单纯缺失型Hb H病（-/-）的临床表现更为严重，特别是基因型为-/CS或-/QS的Hb H病患者，贫血程度较为严重；（4）4个-基因缺失，其基因型为-/-，称为重型-地贫，又称Hb Barts胎儿水肿综合征，此类个体一般无法存活到出生或分娩后半小时内死亡。 -地贫是由于-珠蛋白基因发生突变而引起，以点突变为主，少数为缺失型。-珠
6、蛋白基因簇位于11p15.3，包括2个成人期表达基因（和），基因的排列顺序为5-3。根据-珠蛋白链合成量的程度，可将-地贫分为3类：（1）0地贫，-珠蛋白链完全不能合成，其所在的等位基因称为0地贫等位基因；（2）+地贫，-珠蛋白链合成减少，其所在的等位基因称为+地贫等位基因；（3）+地贫，又称沉默型-地贫，-珠蛋白链合成轻微减少。中国已至少报道84种-珠蛋白基因点突变和11种-珠蛋白基因缺失。其中，6种点突变：HBB：c.126_129delCTTT，HBB：c.52Agt;T，HBB：c.-78Agt;G，HBB： c.79Ggt;A，HBB： c.316-197Cgt;T和HBB： c.2
7、16_217insA占了全部突变类型的90%以上。 -地贫的临床表型可分为4种：（1）静止型-地贫，基因型为+/N，血液学表型正常或临界，一般只能通过分子诊断识别；（2）轻型-地贫，基因型为0/N或+/N，临床表现为小细胞低色素和HbA2值升高；（3）中间型-地贫，基因型为+/+或+/0，表型变异范围大，可从轻度贫血到中度贫血，多于幼儿期出现中度贫血；（4）重型-地贫，基因型为+/0或0/0，通常伴有严重贫血，需要定期输血才能存活。患儿出生时无症状，常于婴儿期（3-12月龄）发病。如不治疗，患儿多于5岁前死亡。此外，中间型的分子基础较为复杂，显性-地贫突变的杂合子（D/N），合并-地贫突变的-
8、地贫突变纯合子（0/0），或合并-珠蛋白三联体的-地贫突变杂合子（0/N或+/N），也会显示中间型的表型。 2022年发布的重型-地中海贫血的诊断和治疗指南明确规定：对于重型-地中海贫血的诊断，有条件者均应进行基因诊断，基因型为纯合子或双重杂合子为确诊本病的指标。2022年发布的儿童非输血依赖型地中海贫血的诊治和管理专家共识也明确规定：地贫基因检测为非输血依赖型地贫的诊断依据之一。 另外，国家卫生健康委员会发布的相关文件要求：为减少重型地贫患儿出生，在我国地贫高发省份实施地贫防控试点项目。主要流程包括：（1）对新婚夫妇和计划怀孕夫妇在怀孕前或孕期进行血常规初筛；（2）对夫妇一方或双方血常规检查
9、结果阳性的夫妇进行血红蛋白分析复筛；（3）对血红蛋白分析复筛结果均为阳性的夫妇，取其抗凝静脉全血进行相应的+地贫基因检测；（4）综合夫妇双方病史询问、地贫筛查和基因检测结果，判定为高风险夫妇。对高风险夫妇进行追踪，及时了解受检妇女怀孕情况，指导女方在怀孕后适宜时期接受产前诊断。产前诊断的对象为胎儿，样本类型为胎儿的绒毛、羊水和脐带血，检测项目为相应的地贫基因检测。 综上，结合该类产品临床使用的实际情况，本指导原则的预期用途可为：用于体外定性检测人外周静脉全血或胎儿羊水等样本中基因组DNA的-和/或-地贫相关基因，用于-和/或-地贫的辅助诊断（遗传诊断），地贫高风险夫妇的评估，或胎儿的产前遗传诊
10、断等。 结合该类产品在中国注册的实际情况以及当前的认知，本指导原则仅对“-和/或-地贫的辅助诊断（遗传诊断）”预期用途的相关内容进行了详细阐述。针对其他预期用途，本指导原则仅对部分内容进行了阐述，申请人应根据产品特性，对本指导原则未涉及的内容进行补充并做出相应评价。 本指导原则的技术要求是基于PCR探针法方法建立的，对于其他分子生物学检测技术（如：PCR-反向点杂交法和gap-PCR法等），可能部分要求不完全适用或本文所述技术指标不够全面，申请人可以根据产品特性对不适用部分进行或补充其他的评价和验证，但需阐述不适用的理由，并验证替代方法的科学合理性。 本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可
11、事项变更的产品。 二、注册申报资料要求 （一）综述资料 综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及国内外同类产品上市情况介绍等内容。其中，同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学、检验原理、检测的突变类型以及临床意义等方面详细说明申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。 综述资料应符合体外诊断试剂注册管理办法（原总局令第5号，以下简称办法）和关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告（原总局公告2022年第44号），以下简称44号公告的要求。 （二）主要原材料的研究资料 主要原材料研究资料包括主要反应成分、对照品（质控品）
12、及企业参考品的研究资料。 1. 此类产品的主要反应成分一般包括人基因组核酸提取/纯化试剂、检测所需引物、探针、酶、dNTPs、反应缓冲液等。申请人应提交相关原材料的选择、制备和质量标准等的研究资料。如为申请人自制，应提交详细的工艺稳定性研究资料；如为外购，还应提交供应商筛选资料以及供应商提供的原材料质量检定报告。 1.1 核酸提取/纯化试剂（如有）的主要组成、原理介绍及相关的验证资料。 1.2 引物、探针 申请人应详述引物、探针的设计原则，提供引物、探针核酸序列、模板核酸序列及两者的对应情况。建议设计多套引物探针以供筛选，针对待测位点的特异性等进行评价，选择最佳设计，并提交详细的筛选研究数据。
13、 申请人应针对选定的引物、探针原材料进行质量评价，一般包括：分子量、纯度（HPLC等）、浓度、探针荧光标记基团的激发波长和发射波长，以及功能性试验等，并依据评价结果建立合理的质量标准。 1.3酶 酶包括DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）等。申请人应针对各种酶的活性进行验证，提交功能性试验资料，并确定酶的质量标准。 DNA聚合酶应具有DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性，具热稳定性。UDG/UNG应具有水解尿嘧啶糖苷键的活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性。 1.4脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs） 包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP；应提交对其纯度、浓度、保存稳定
14、性等的验证资料，以及功能性试验资料，并确定质量标准。 2. 对照品（质控品） 试剂盒的质控体系通过设置各种试剂盒对照品（质控品）来实现。阳性对照应至少包括代表性的突变位点和突变类型。阴性对照可以是含有野生型序列的核酸溶液。空白对照为不含核酸的溶液。 如该类产品所采用的方法学和检验原理显示：无论检测何种样本（野生型、杂合突变和纯合突变），其反应体系均可报出核酸序列结果，均可对管内抑制导致的假阴性结果进行质量控制，则无需另外设置内标；否则，试剂盒应另外设置内标。 对照品可采用人基因组DNA、细胞系或质粒等。空白对照应参与样本核酸的平行提取。申请人应提供对照品原料选择、制备、定值过程等的详细研究数据
15、，并对其检测结果做出明确的范围要求。 3. 企业参考品 企业参考品主要包括阳性参考品、阴性参考品、检测限参考品和精密度参考品等。申请人应提交企业参考品的原料选择、制备方法、基因序列确认及检验标准的详细研究资料等。 3.1 阳性参考品：可采用临床样本或其核酸溶液，如采用临床样本，则样本类型应与待测样本一致。应至少包含所有检测位点的杂合型样本，同时尽量纳入纯合突变型样本。对于某些稀有基因型，也可采用细胞系或质粒。 3.2 阴性参考品：应包括野生型临床样本或其核酸溶液，以及易产生交叉反应的同源序列样本，同时应尽量包含检测范围外其他检测位点的样本等。 3.3检测限参考品可选择最低检测限浓度（例如：95%检出率水平）或接近最低检测限浓度（例如100%检出率水平）的临床样本或其核酸溶液，至少包含所有检测位点的杂合型样本。 3.4 精密度参考品应至少包
