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1、感受态的制备与转化，质粒提取（原理和操作步骤）感受态细胞: 理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来 DNA 的生理状态。即 指细菌细胞在一定的生长阶段，自身或通过人为处理而具有摄取外源DNA并使其基因型和表 现型发生相应变化的能力。如大肠杆菌经CaC12处理，就成为容易受质粒DNA转化的细胞。一般来说，感受态细胞的最基本要求是：1、没有质粒2、容易被转进去（一般是G-细菌，细胞壁薄）3、营养条件一般，非苛养菌CaCl2 法：操作原理：1. 将快速生长的大肠杆菌置于经低温（oc）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成 细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内
2、膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞细胞膜通透性发生变化，极易与外源 DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核 酸酶的羟基一磷酸钙复合物。2. 此时，将该体系转移到42C下做短暂的热刺激（90s ），细胞膜的液晶结构会发生 剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源 DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源 DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。3. 将转化后的细胞在 选择性培养基 上培养，筛选出带有外源 DNA分子的阳性克隆 意义：将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成 功，最主要的是感受态细胞作为重组载体
3、的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达 纯化等工作。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以他为载体构建的重组子导入细菌的过程。实验材料：E. col DH5a 菌株：R_,M_,Amp_； pBS 质粒 DNA； eppendorf 管。试剂:1. LB 固体和液体培养基2. Amp 母液 （储存浓度 50mg/ml）3. 含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60C左右，加入 Amp储存液，使终浓度为50ug/ml，摇匀后铺板。4.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2（无水，分析纯）,溶于50ml重蒸水中,定容至 1
4、00ml,高压灭菌。5.含15%甘油的0.05mol/L CaCI2：称取0.28g CaCI2（无水,分析纯）溶于50ml重蒸水 中，加入15ml甘油,定容至100ml，高压灭菌。氨苄青霉素贮存液：脓度50-100mg / mL；溶液 I：, 50mmol/L 葡萄糖，10mmol/L EDTA(pH8.0), 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)； 溶液II： 0.2mol/L NaOH, 1%SDS (现配现用)；溶液III：乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)( 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml 冰醋酸，28.5mL H2O)；一、受体菌的培养-80 C冰柜中
5、，取出一支冻存菌株，于事先照过紫外的超净台中，用无菌的接种环轻轻蘸取 菌种后，在无抗平板上划线，并将菌种迅速放回-80C保存。在划线板上做好相应标记，于 37C培养16-20小时。在照过紫外的超净台中，用灼烧并冷却后的镊子夹住一个20 ul枪头（或者灭过菌的牙签）， 从LB平板上挑取新活化的E. coliDH5a单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中,37C下 振荡培养12小时左右（或过夜，220rpm）,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50 的比例接种于100ml LB液体培养基中（据其他资料：取50或100ul菌液接种于5ml的 培养基中）,37C振荡培养2-3小时至0D
6、600 =0.30.5左右。细胞数小于10的8次 方, 过夜菌按比例转接至准备好的液体培养基中。一般转接菌液与培养基体积比例不得大于1 : 10,即转接菌液:培养基体积三1:10。培养基体积与三角瓶体积比不得小于1 :5,即培养基体积:三角瓶体积三1:5。要有足够的空间提供溶氧。）OD值是一个重要的参数，当OD600值大于一定值时，菌体不会保持对数生长。同时，OD 值大时菌体总量达，所以需要在这两个方面的影响中找到一个平衡点。不同的菌种所对应的 值不一样。二、感受态细胞的制备（CaCl2法）1、将细菌悬液液转入离心管（1.5ml）中，冰上放置10分钟,然后于4C下3000g离心10 分钟。2、
7、弃去上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30 分钟后,4C下3000g离心10分钟。（有些微0.1mol/L的CaCl2）3、弃去上清，加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞，冰上 放置几分钟,即成感受态细胞悬液。（15% - 20%甘油为细菌的冷冻保护剂，也可在此步骤不 加甘油，细胞直接用于转化）4、感受态细胞分装成200pl的小份，贮存于-70C可保存半年。三、转化1、从-70C冰箱中取200pl感受态细胞悬液，室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。2、加入pBS质粒DNA溶液（含量不超过50ng,体积不超过
8、10川）,轻轻摇匀，冰上放置30 分钟后。（有资料为200ul加1ng质粒）3、42C水浴中热击90秒或37C水浴5分钟，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。4、向管中加入1ml LB液体培养基（不含Amp）,混匀后37C振荡培养1小时，使细菌恢复 正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Amp r ）。5、将上述菌液摇匀后取100川涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时,待菌液 完全被培养基吸收后倒置培养皿,37C培养16-24小时。同时应做两个对照:对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常 情况下在含抗生素的 LB 平板上应没有菌落出现。对照组
9、2:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5川菌液涂布于 不含抗生素的 LB 平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。四、计算转化率统计每个培养皿中的菌落数。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化 子总数和转化频率，公式如下：转化子总数=菌落数x稀释倍数x转化反应原液总体积/涂板菌液体积 转化频率（转化子数/每mg质粒DNA）=转化子总数/质粒DNA加入量（mg） 感受态细胞总数=对照组2菌落数x稀释倍数x菌液总体积/涂板菌液体积 感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数注意事项：本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的
10、转化。但它们的 转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落 平板，而有的转化效率低，涂板时必须将菌液浓缩（如离心）,才能较准确的计算转化率。3个因素对于获得持续高的转化频率来说是至关重要的：（1）转化缓冲液中试剂的纯度务必使用所能得到的最高质量的试剂，这些试剂应分装成小 份，避光保存于冷处。（2）细胞的生长状态由于一些不清楚的原因，直接用贮存于VOt冰冻培养基中的贮存原 种接种而进持培养的细菌，所得到的转化效率最高，不应使用在实验室中连续传代， 贮存于4或贮存于室温的培养物。（3）玻璃和塑料器皿的清洁度痕量的去污剂或其他化学物质的存在可能大大地降低细菌的
11、生长效率，所以最好拨出一批玻璃器皿专用于制备感受态细菌，而不作它用。制备感受态细胞时，测0D600在0.30.5之间，空白用无菌体的LB培养基。（菌体的OD600 值，JM109或BL21, OD值为0.35, DH5a为0.4，要尽量保证OD值不要过高，更不能超 过 0.6）感受态的感受效率最关键的是一个冷字，刚制备的感受态其感受效果最好，但是随着时间的 延长感受效果会逐渐下降，所以要将制好的感受态细胞冻存于液氮中，或-70度冰箱保存， 这样感受效果才不至下降过快。一般感受态制备好以后24小时其转化效率最高，随后就逐 渐下降。一般的宿主菌都不要传代太多，传多了就容易状态不好和污染杂菌。状态好
12、的时候 建议冻上一批，用 EP 管分装好，然后，每次就可以取冻存的菌种来扩增使用。 试剂和用品，非如果有可能，所有的用品（离心管、摇瓶等等）用新的，如果使用旧的，要 确保干净。制备质粒 DNA:碱裂解法小量制备质粒DNA :碱裂解法是基于线性大分子染色体DNA与小分子环形质粒 DNA的变性复性的差异达到分离目的的，在pH12.012.6的碱性环境中，线型染色体DNA 和环型质粒DNA氢键会发生断裂，双链解开而变性，但质粒DNA由于其闭合环型结构，氢键仅发生部分断裂，而且其互补链不完全分离；当将pH值调节到中性并在高盐浓度下，已 分开的染色体DNA互补链不能复性而交联形成不溶的网状结构，通过离心
13、，大部分染色体 DNA、不稳定的大分子RNA和蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，而部分变性的 闭合环状的质粒DNA在中性条件下很快复性，恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶 液中，离心后上清中便含有所需要的质粒DNA。步骤：1、挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到液体培养基中，37C震荡培养1216小 时；2、将1.5mL菌液加入Ep离心管中，12000 g离心30 Sec,弃上清液，在吸水纸上扣干； 离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮3、加入100mL预冷的溶液I ,于涡旋振荡器上振荡悬浮细菌细胞，尽量使细胞分散；溶液I中的葡萄糖的作用是增大让一让的粘度，减少提取过
14、程中的机械剪切力，防止染色体DNA的断裂；EDTA的作用是与二价离子（Ca2 +）结合，降低DNase对DNA的降解。4、加入200mL新配制的溶液II,盖紧管口，快速颠倒离心管,以混匀内容物，冰上放置35min; 溶液II中的N aO H与SDS可裂解细胞，使DNA变性以及SDS使蛋白变性并形成交联的网状 结构5、加入150ml溶液III,加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置23min；溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH,以便使部分变性的闭环质粒复性，而细菌 染色体DNA不能正确复性6、12000 g离心6 min,将上清移入另一干净的Ep管中；7、加2倍上清体积（约1mL）的无水乙
15、醇，振荡混匀，室温放置2min.8、12000g离心10min,弃上清液，再用70%的乙醇洗涤一次，12000g离心1min,离心管倒 置于吸水纸上扣干，然后在中空浓缩系统上干燥质粒；9、加入40mL含20 mg/mL RNase A的灭菌蒸馏水或TE缓冲液溶解提取物，室温放置直到质 粒完全溶解（约8min）,存于一20 C或直接用于酶切。质粒图谱:pGEX-4F ogThfEmainI #：u Va Pit CE- Srn- Ipri Cy 関 卩帕 C v 皋i! Itir JWJi 抽 Mil .Un ShiI n I f;|比CCA珮切 I 懐l：龄 ICC 擀瞭话地P IOC-UBajiH II:胡和I 佣|怙” I ，亦 加汀囂Bp书皿何Ba mH I EcoR I Sal I EcoR I厂 GST 论IEpGEXPDIP-r5841 bppBR322 on如I4UI（四）提取质粒的酶切鉴定与琼脂糖凝胶电泳：1、在0.5mL Ep管中依次加入下列溶液于0.5ml离心管中提取质粒DNA3.0 uL10x buffer H1.0 ulEcoR I2.0 Udd H2O5.8 uL10 uL1U: 1单位酶通常定义为，在建议缓冲液及温度下，在20 mL反应液中反应lh,使1 mg DNA完全消
