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1、生物技术类大实验实验指导书2009年9月1日前 言生物技术大实验是为生物技术专业本科高年级学生开设的综合实验课程，是在普通生物学实验、生物化学实验、微生物实验、细胞生物学和遗传学实验的基础上的综合实验课程。该实验课程偏重于分子生物学实验教学，通过此实验课程，学生不仅学习到最基本的分子生物学技术，而且学习到前沿的生物技术。分子生物学实验技术突飞猛进，日新月异。分子生物学技术的广泛应用，在20世纪下半叶对生命科学的进步产生了举世公认的巨大推动作用，而且对人们的生活和整个社会的发展亦产生了巨大的冲击和影响。分子生物学技术已广泛渗透和应用到生物学、遗传学、细胞学、微生物学、进化学、肿瘤学、免疫学、药理
2、学、发育学、病毒学、神经生物学、生药学、法医学等与基础医学和临床医学有关的研究领域。21世纪将更是分子生物学技术快速发展的时期，由此引起的生物技术革命并将更加深刻地影响社会的发展。学生基本技能和动手能力的培养都离不开实验室，离不开实验课上的训练，很多理论上的原理都需要到实验课上去验证，很多理论上的知识都需要到实验课上去实践。而实验课教材或实验指导书是开好实验课的基本条件之一。虽然目前的分子生物学实验教材版本众多，但针对本科生的生物技术大实验教材尚无出版。为了加强本学科的教材建设，促进本学科实验课的开设，我们参考了国内外最新的有关分子生物学实验技术的专著，根据我校学生的特点及我们自己现有的基础和
3、条件，特选择了部分实验内容，并结合我们的经验与体会，汇编成了生物技术大实验实验指导书，以供参考。在使用过程中，可根据不同的层次适当增减。同时，对于新近产生和应用前景广阔的生物芯片技术、RNAi技术和蛋白质组研究等，限于我们目前的条件，只能作些演示或作为动态给以介绍，条件一经成熟，即行开设。由于分子生物学技术和生物技术的快速发展，加之我们是第一次这样系统地给学生开设生物技术大试验课程，许多工作还处于不断探索的过程中，难免有不妥和疏漏之处，恳切期望读者提出宝贵意见，以利不断修正完善。目 录注意：值日生的任务是协助实验准备及实验室卫生清扫，具体工作时间和任务由负责研究生安排（平时可能要做一些实验准备
4、，如预实验、配液等。要求必须提前30分钟到实验室），老师监督并作为平时成绩考核。时间安排，每次课6-8学时，周三8：50-15：50；周四8：50-13：50，周六8：50-16：50；周日8：50-16：50；有些实验时间可能增加，视实验任务而定。无特别安排暂定周六1班和周日2班，有变动商议后提前告知。实验1、从动物组织中提取基因组DNA（刘小龙，徐鹏如）【值日生：06-1班 蔡晗、陈作深、陈顺艳、邓大标；06-2班 戴殷、邓科源、邓修康、高甘梅】实验2、PCR扩增基因特异片段（刘小龙，徐鹏如）【值日生：06-1班蔡晗、陈作深、陈顺艳、邓大标；06-2班戴殷、邓科源、邓修康、高甘梅】实验3、
5、DNA片段的回收及纯化（何伟璇，熊接华）【06-1班 冯剑平、甘燕贞、霍嘉玲、李鉴清；06-2班 邓勇、黄晓灵、贾小艳、李慧莹】实验4、PCR产物的TA克隆（何伟璇，熊接华）【06-1班 冯剑平、甘燕贞、霍嘉玲、李鉴清；06-2班 邓勇、黄晓灵、贾小艳、李慧莹】实验5、感受态大肠杆菌细胞的制备（CaCL2法）与质粒转化（王瑞晓，汪元梅）【06-1班 李宝红、李仕勇、林世亮、刘成模；06-2班 胡博、李丽坤、李晓鹏、李雯榕】实验6、PCR法快速鉴定重组载体（菌落鉴定）（王瑞晓，汪元梅）【06-1班 李宝红、李仕勇、林世亮、刘成模；06-2班 胡博、李丽坤、李晓鹏、李雯榕】实验7、质粒的提取和纯化
6、（蔡伟光，肖敏）【06-1班 刘青、罗龙清、罗月明、王光真；06-2班李炫、梁惠娟、梁礼健、梁勇】实验8、质粒DNA的电泳和纯度检测（蔡伟光，肖敏）【06-1班 刘青、罗龙清、罗月明、王光真；06-2班 李炫、梁惠娟、梁礼健、梁勇】实验9、限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒.（杨林，柒启恩）【06-1班 田朝阳、邬黎、王斌、王娟娟；06-2班 林鑫城、饶靖、司徒昭韵、孙文俊】实验10、外源基因表达载体的克隆（杨林，柒启恩）【06-1班 田朝阳、邬黎、王斌、王娟娟；06-2班 林鑫城、饶靖、司徒昭韵、孙文俊】实验11、外源基因在大肠杆菌中的表达（赵增阳，程晓）【06-1班 徐国华、徐小珊、姚光宇、余
7、凌冰；06-2班涂子璐、徐建、许佳俊、杨志强】实验12、目标蛋白的PAGE检测（赵增阳，程晓）【06-1班 徐国华、徐小珊、姚光宇、余凌冰；06-2班涂子璐、徐建、许佳俊、杨志强】实验13、RNA的提取及其纯度检测（李虹仪，程晓）【06-1班 曾国章、曾秋丽、曾龙、张雨微；06-2班曾李、詹桂琴、周太刚、邹韵】实验14、逆转录PCR（RT-PCR）扩增基因特异片段（限选）（李虹仪，程晓）【06-1班 曾国章、曾秋丽、曾龙、张雨微；06-2班曾李、詹桂琴、周太刚、邹韵】实验1、从动物组织中提取基因组DNA（一）实验目的通过实验掌握从动物组织中提取DNA的基本原理和基本方法。(二) 实验原理在ED
8、TA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K笑话细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动物基因组DNA，用此法得到的DNA长度为100-150kb，适用于噬菌体构建基因组文库和DNA印迹分析。（三）试剂、材料、仪器与器材1. 试剂与材料1) TrisHCL 1mol/L PH8.0 50ml配制方法：40ml双蒸水，6.057g固体Tris放入烧杯中溶解，用浓盐酸调PH值到8.0，转移到50ml容量瓶中，加入双蒸水定容，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4保存备用。2) 生理盐水: 0.85%NaCL 100ml配制方法：在20ml双蒸水中溶解0.85g固体NaCL，加水定容至
9、100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4保存备用。3) EDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml配制方法：将9.08g的EDTANa22H2O溶解于40ml双蒸水，用1g的NaOH颗粒（慢慢逐步加入）调PH值到8.0，用50ml容量瓶定容，如果EDTA难溶，先加NaOH溶解，然后逐步加EDTANa22H2O。4) TES缓冲液（释放DNA） 100ml配制方法：将0.5844g的5 mol/lNaCl溶解于80ml双蒸水，在分别加入1ml的0.5 mol/l EDTA、0.2ml的Tris-HCl (pH=8.0)，加定容至100ml, 摇匀后，转到
10、准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4保存备用。5) 10% SDS（变性剂 破细胞壁）100ml配制方法：将10g的十二烷基硫酸钠（SDS）溶解于80ml双蒸水于68加热溶解，用浓HCl调至PH=7.2，定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，4保存备用。6) 蛋白酶K（降解蛋白质）：20mg/mL 无菌三蒸水溶解。7) RNA酶 （降解RNA）（选配）配制方法：将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/L的TrisCL（PH7.5）、15mmol/LNaCL中，配成10mg/ml的浓度，于100加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份存于20。8) 氯仿
11、：异戊醇=24：1 100ml按24:1的比例加入氯仿、异戊醇，摇匀，转到准备好的瓶中，贴上标签，4保存备用。9) TE缓冲液（溶解DNA） PH8.0 50ml配制方法：将0.5ml 的10mmol Tris-HCl(PH8.0) 、0.1ml的0.5mol/l EDTA(PH8.0) 加入到50ml的容量瓶中，调PH8.0定容至50ml摇匀后，转到准备好的瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4保存备用。2. 仪器与器材移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、恒温水浴箱。（四）操作步骤1. 组织块解冻，取适量组织于PBS溶液中清洗干净后放入装有500微升PBS的离心管中（1.5ml），用剪刀剪
12、碎；12000rpm离心8min，取出弃上清；2. 加入0.45ml TES混匀，再加入50ul SDS（10%），20ul蛋白酶K（20mg/ml），充分混匀后，于56保温4-6h，每2h摇1次,至体系透亮为好。3. 放置到室温，加入等体积饱和酚（500ul），上下温柔翻转5min,12000r/m，离心10min，分离水相和有机相，小心吸取上层含核酸的水相，到一个新的1.5ml离心管。4. 加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），上下温柔翻转5min，12000r/m，离心10分钟，取上层转移到新的1.5ml离心管中。5. 加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），上下温柔翻转5min，1
13、0000r/m，离心10分钟，取上层清液到一个新的1.5ml离心管。6. 加入1/10体积的NaAc（4保存），加入2倍体积的-20预冷的无水乙醇沉淀DNA，置于-20中保存30min或更久；观察现象。7. 12000 r/m，离心10分钟，弃乙醇。8. -20保存的75%乙醇洗涤，12000 r/m，离心5分钟，去乙醇，55干燥DNA。9. 加入适量TE溶解DNA（具体依DNA的多少而定）（一般50L），-20保存备用。如果除去其中的RNA，可加5l RNaseA(10g/l),37保温30min，用苯酚抽提后，按步骤9和10重沉淀DNA。（五）注意事项1. 要充分除去DNA提取液中的苯酚，
14、否则会影响以后的操作。2. 用酚-氯仿-异戊醇（体积比为25：24：1）抽提后取上清是不能将中间的蛋白质扰动，以防蛋白质污染。3. 酚-氯仿-异戊醇中的异戊醇是用来消除实验中可能产生的泡沫。4. 抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切力对DNA的损伤。5. 取上层清液时，注意不要吸起中间的蛋白质层。6. 乙醇漂洗去乙醇时，不要荡起DNA。7. 离心后，不要晃动离心管，拿管要稳，斜面朝外。(六）思考题1. 操作4中的蛋白酶K有什么作用？2. 操作7中的乙醚有什么作用？3. 如何除去DNA提取物中的RNA？实验2、PCR扩增基因特异片段（一）实验目的 学习PCR体外扩增的原理及其引物设计原则；了解扩增
15、过程中各因素对扩增结果的影响；掌握PCR的基本操作。（二）实验原理 PCR(polymerase chain reaction)是在体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应。在分子生物学研究中，广泛地应用于研究基因突变，获取加上酶切位点的目的基因和DNA序列测定等方面，是分子生物学中一项极为常用的技术。 PCR的原理是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。两个引物分别位于靶序列的两端，同两条模板的3端互补，由此限定扩增片段。PCR反应由一系列的变性退火延伸反复循环构成，即在高温下模板双链DNA变性解链，然后在较低的温度下同过量的引物退火，再在适中的温度下由DNA聚合酶催化进行延伸。由于每一循环的产物都可作为下一循环反应的模板，因此扩增产物的量以指数级方式增加。理论上，经过n次循环可使特定片段扩增到2n-1，考虑到扩增效率不可能达到100，实际上要少些，通常经2530次循环可扩增106倍，这个量足够分子生物学研究的一般要求。1 PCR引物设计(1) Tm值 Tm值是PCR引物设计中的一个重要参数，是指引物与模板之间精确互补并且在模板过
