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1、硫酸铜对蚕豆根尖细胞微核效应的研究硫酸铜对蚕豆根尖细胞微核效应的研究前言：如今环境重金属污染已引起广泛关注。蚕豆根尖细胞在分裂期间对外界环境反应敏感, 造成染色体畸变、微核等分裂异常现象, 其变异率与污染物种类及浓度相关, 因此可利用蚕豆根尖分裂细胞的微核率测知污染物的环境毒理效应。蚕豆(Vicia faba)是一种理想的细胞遗传学研究材料。蚕豆的染色体大，数量少(2n=12),根尖中含有较多的分裂相细胞，非常适合显微观察，而且蚕豆根尖细胞周期中的大部分时间对诱变剂敏感，便于遗传毒性检测实验。本实验利用蚕豆根尖微核技术, 研究了不同浓度的硫酸铜对蚕豆根尖细胞微核诱变的影响, 从而从细胞的水平上
2、来研究重金属的毒害机理, 为进一步评价环境质量具有重要意义。1 概述如今环境重金属污染已引起广泛关注。植物对重金属的吸收、积累及重金属对植物的生理生化特性的影响已有较多报道, 而其对染色体行为的影响少见报道。蚕豆根尖细胞在分裂期间对外界环境反应敏感, 造成染色体畸变、微核等分裂异常现象, 其变异率与污染物种类及浓度相关, 因此可利用蚕豆根尖分裂细胞的微核率测知污染物的环境毒理效应。随着微核形成机制的阐明以及检测手段和实验技术的不断改进和完善, 蚕豆根尖微核试验在重金应用。本实验利用蚕豆根尖微核技术, 研究了不同浓度的重金属对蚕豆根尖细胞微核诱变的影响, 从而从细胞的水平上来研究重金属的毒害机理
3、, 为进一步评价环境质量具有重要意义。2 材料和方法2.1实验材料A实验材料：蚕豆种子B. 实验器材1 光学显微镜2 试管(10ml)23 蚕豆发芽盒4 其它：镊子、手术刀、载玻片、盖玻片、滤纸等。C. 试剂1 硫酸铜溶液：1g/L、5g/L、10g/L2 卡诺氏固定液：将乙醇和冰醋酸以3：1(V/V)混和配制；3 水解分离液：盐酸与95%酒精1：1混合；4 改良苯酚品红染液母液：将3.0g碱性品红溶解在100ml 70%乙醇中，以1:9的比例将其与5%苯酚溶液混和，即得到改良苯酚品红染液母液。5 苯酚品红染液：将45ml母液，6ml冰醋酸，6ml 37%甲醛混合均匀。6 改良苯酚品红染液：2
4、0ml苯酚品红染液加入180ml 45%乙酸和3.6g山梨醇，静置两周后使用。2.2 实验方法2.2.1 蚕豆种子的浸种与催芽浸种准备好的蚕豆种子，按需要量放入盛有自来水的烧杯中，置于25 摄氏度的温箱中预热。如室温超过25度，即可在室温下进行浸种催芽（约24小时）。催芽待种子吸胀后，用纱布松松包裹置解剖盘或烧杯中，保持湿度，在25摄氏度的温箱中催芽12h-24h，待种子出生根露出2 mm-3 mm时，选取发芽良好的种子，放入铺有薄薄一层的湿脱脂棉的解剖盘中，仍置于25摄氏度温箱中继续催芽，注意保持湿度。再经过36h-48h，种子大部分初生根长至1.53.0cm，根尖发育良好，这时就可用于监测
5、水样或检测药物溶液诱变效应。2.2.2 染毒与修复培养每组选择6-8粒发芽良好的蚕豆种子，用配制好的不同浓度的硫酸铜溶液（1g/L、5g/L、10g/L）染毒处理6小时后（使根尖完全浸入处理水样中，）取出后用蒸馏水冲洗（3次,每次2-3分钟），并移至蒸馏水中修复培养2226小时（蒸馏水浸住根尖）。 2.2.3 材料固定借助于物理方法或化学药剂的作用，迅速透入组织和细胞将之杀死，并且使其结构和内含物如：蛋白质，脂肪，糖类以及核物质与细胞器等，在形态结构上尽可能保持生活时的完整和真实状态，同时更易于染色，可以较清楚的显现细胞在生活时不易看清的结构。 吸取约5ml卡诺氏固定液于10ml试管中，用刀片
6、或小剪刀切取经过处理的长约0.5-1.0cm的幼根，放入试管内，用试管塞盖紧，室温下固定20-24h，固定液的用量为材料体积的15倍以上。2.2.4 水解分离水解分离的作用是去除细胞内未固定的蛋白质, 同时使胞间层的果胶类物质解体，细胞分散而易于观察。用镊子取固定好的蚕豆根尖，放在试管内，加水解分离液2ml，室温下处理8-20min，倒去水解分离液，再加入固定液2ml，软化5min，软化对细胞壁起腐蚀作用。然后倒去固定液，用蒸馏水反复冲洗使材料呈白色微透明，以镊子柄轻压能压碎为佳。2.2.5 染色和压片切取蚕豆根尖分生组织放在载玻片上纵横切成几段，放在载玻片上，以十字压片法覆以载玻片，用镊子柄
7、或铅笔头轻敲几下，再用拇指用力下压使细胞充分分散，注意不要移动玻片，然后分开两玻片，各滴上1-2滴染液，染色20-30min后加上盖玻片，注意不要产生气泡，最后用吸水纸吸去多余染液。2.2.6 镜检在4010倍镜显微镜下，凡小于主核1/4以下的，同主核有相同染色效果的，圆形、椭圆形或其他类似的形状的染色物质都可以算作微核。3 结果与讨论3.1 在显微镜下, 1g/LCuSO4溶液下可以观察到微核, 而5g/L和10g/L的CuSO4溶液下看不到微核。从观察到的微核可以判断出微核的着色与主核相当或略浅一些, 其形态为圆形, 椭圆形或不规则形, 大小在主核1 /3以下, 图：3.2 CuSO4溶液
8、下蚕豆根尖微核数的统计CuSO4浓度（g/L）0（对照组）1510有无微核无有（少）无无3.3 由实验结果可以看到，对照组没有出现微核，CuSO4溶液浓度在1g/L的时候，蚕豆根尖细胞产生微核，而在5g/L和10g/L硫酸铜溶液时没有微核出现，原因可能是：高浓度的重金属溶液处理蚕豆根尖导致微核率下降，但细胞受损伤的程度更为严重，使细胞周期不能正常运转，细胞不能得到更新，植物体生命活动受到更严重的影响。3.4 查阅相关文献，可以看到有实验结果证明，在铜（Cu2+）溶液染毒的情况下，在0.050.1g/L之间微核数达到最大值，浓度继续增大时，微核数就开始下降。而5g/L、10g/L远远超过了0.1
9、g/L。3.5有关资料表明，微核的形成途径有两条：一条途径是由于前一分裂周期G期后产生的染色体断片在分裂过程中不能与正常染色体协调活动，在进入间期时，即被排斥于核外形成的；另一条途径是由于各种形式的落后染色体、未及中板集合染色体以及染色体分组造成的。当硫酸铜溶液浓度超过一定值时，重金属离子不仅导致细胞内染色体畸变的产生，而且有效地阻止了细胞内纺锤体微管的组装，使细胞分裂器不能形成，而使细胞周期停留在分裂期，不能运行到间期，进而使间期的微核率下降。 3.6 查阅相关文献都可以得到，随着金属浓度的增大，微核率也随着增大，这可能是因为随着处理溶液浓度的升高，重金属对细胞中染色质的诱变致畸作用加强，导
10、致染色体畸变率升高,微核率也随之增加。4、结论和总结 在硫酸铜浓度1g/L时，我们可以观察到微核，而在对照组和浓度为5g/L、10g/L时没有微核产生，原因可能是高浓度的重金属溶液处理蚕豆根尖导致微核率下降，但细胞受损伤的程度更为严重，使细胞周期不能正常运转，细胞不能得到更新，植物体生命活动受到更严重的影响。 由于事前没有充分查找相关的资料，导致处理毒液的浓度不合适，偏高。5、参考文献1 钱晓薇. 硫酸铜对蚕豆根尖细胞有丝分裂的影响J. 细胞生物学杂志, ,26(1):172-1762 杨再福铜(Cu2+)对中华大蟾蜍蝌蚪的毒性试验J环境保护科学，2000，26(101):37-383钱晓薇.乙酸铜对蚕豆根尖细胞致畸效应J.细胞生物学杂志,2005,27:351-3574钱晓薇.氯化汞对蚕豆根尖细胞致畸效应的研究J.遗传,2004,26(3):337-3425李宏.饱和对二氯苯液诱导小麦根尖细胞异常性的研究J.渝州大学学报(自然科学版),1997,14(1):36-423
