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1、生物显微技术讲义唐山师范学院生命科学系陈超 石洪凌2005.3前言生物显微技术是高等院校生物系各专业的基础课,包含生物材料固定技术、生物染色技术、各种显微切片制作技术、显微化学技术显微摄影技术。通过这门课的学习，希望能够帮助大家加强生物实验的技能。使学生掌握制作动、植物显微切片的技术,掌握使用光学显微镜及进行显微摄影所必备的基本理论、基本知识和基本技术。本生物显微技术大实验是为了配合这门课的教学，在参考了国内一些相关教材的基础上，结合本教研室的历年实验经验与心得而编写的，仅供唐山师范学院生命科学系学生使用。生物显微技术的内容在其他教材中叙述比较零乱，没有统一的整体性。本指导在结合我系教学安排和
2、实验的前提下，有针对性的安排了生物显微技术的理论教授和实验指导。内容主要包括石蜡切片的制作、显微摄影知识、数码显微镜及软件的使用。 由于编者业务水平和工作经验所限，虽然做了大量努力，书中难免还会存在缺点和不足。为此切盼广大师生在使用本书过程中能提出批评和建议，以备在以后的日子里改进和提高。 编者2005年1月于唐山师范学院目录第一章生物制片.4 第一节前期准备.4 第二节生物制片分类.8 第三节石蜡切片 .10第二章显微摄影技术.37第三章暗室技术48 第一节感光材料.48 附 彩色显微摄影和黑白显微摄影的相关知识53第二节暗房工艺57第四章数码显微摄影64实验一 徒手切片与整体制片法. .6
3、6实验二 1、石蜡切片技术固定、染色、返蓝702、石蜡切片技术脱水、透明、浸蜡、包埋.72 3、石蜡切片技术切片、粘片、脱蜡、透明、封藏 74实验三 显微摄影及暗室技术78实验四 数码显微摄影及研究分析软件的使用 88实验五 所作切片的观察照相、提交作业 99第一章 生物制片第一节 前期准备一、玻璃器皿的清洗：（一）生物学实验使用的玻璃器皿及玻片均要清洗干净, 应以壁面被水均匀润湿而无水珠为标准。表1-1一般器皿的洗涤方法玻璃器皿可选用洗涤液及洗涤方法新购置未用过的器皿一般使用过的器皿沾有不溶物或刷洗不易达到的器皿沾有较多凡士林或其他油污的器皿沾有油脂物质的器皿洗衣粉、洗涤剂煮洗，或重铬酸钾洗
4、液浸洗30分钟洗衣粉、洗涤剂刷洗重铬酸钾洗液浸泡先用二甲苯或汽油擦洗，再用浓碱或热洗涤剂刷洗热洗涤剂，或3040%的碱液 玻璃器皿经洗涤液清洗后自来水冲洗蒸馏水冲洗倒放于大张滤纸上晾干或玻璃仪器烘干器烘干。（二）洗液配法：重铬酸钾 20g 浓硫酸 100ml 清水 100ml先将重铬酸钾溶于水中，在一滴滴加入浓硫酸，边加边搅拌，颜色为红褐色放于玻璃容器内可反复使用，一直到颜色变为蓝黑色为止。（三）新旧载玻片及盖玻片的清洗：1新的：2%盐酸酒精（95%酒精100份加浓盐酸2份）浸泡几个小时流水冲洗干净95%酒精中待用。2.旧的：没用树胶封片的：洗衣粉煮沸5-10分钟清水冲洗洗液30分钟流水冲洗蒸
5、馏水洗净95%酒精中待用。3.树胶封片的玻片：二甲苯浸泡、洗净95%酒精中待用。二、溶液的配制：（一）百分比浓度 :质量百分比浓度。即100g溶液中所含溶质的克数。1.稀溶液的配置：例1：1%的番红水溶液即将番红1克溶解于100 ml的蒸馏水中。例2：0.1%固绿酒精溶液即将固绿0.1克溶解于100ml的95%酒精中。2.浓溶液的配置：配置高浓度的溶液，应在100ml的水中减去溶质重量的水。例：15%NaCL称取15gNaCL,溶于85ml水中。（二）摩尔浓度：1升溶液中所含溶质的mol数。用M表示。例：配制500ml 2M NaCO3溶液 称取21060.5=106g NaCO3溶于500m
6、l水中。（三）当量浓度：1升溶液中所含溶质的克当量数。用N表示。当量（E）与分子量（MW）的关系：E=MW/n其中酸的n为酸分子中可被金属取代的氢原子数碱的n为碱分子中金属的原子价盐类的n为盐分子中金属的原子数乘金属的原子价如：HNO3的当量=63/1=63H2SO4的当量=98/2=49Ca(OH)2的当量=74/2=37Al2(SO4)3的当量=342/2*3=57一般溶液的配制用烧杯、量筒；准确溶液的配制用容量瓶。(四)酒精稀释法（交叉稀释法）：95%酒精83%酒精先在量筒中加入83ml95%酒精,再加水至95ml即得。95%酒精70%酒精先在量筒中加入70ml95%酒精,再加水至95m
7、l即得。95%酒精50%酒精先在量筒中加入50ml95%酒精,再加水至95ml即得。95%酒精35%酒精先在量筒中加入35ml95%酒精,再加水至95ml即得。（五）常用液态酸的配置：表1-2常用液态酸的配制酸名分子量比重酸浓度（%）摩尔浓度(mol/L)配制1M所需溶质的量（ml） 盐酸硝酸硫酸磷酸高氯酸冰醋酸36.4663.0298.0898.0100.5060.031.191.421.841.691.671.0636.069.596.085.070.099.511.715.617.9514.711.6517.685.564.155.768.085.856.8三、制定实验计划：制定计划时首
8、先要考虑到制片的目的，其次是选择制片的标本，最后才是确定具体的制作方法。例如制玉米茎的横切面，其目的在于观察维管束的结构，那么就应选择老的茎作标本。又如作某一种叶子的生态解剖，所选择的标本就不应该再同一地点，应在不同环境条件下多采集几份，才好做比较。由此可见制片的目的与标本选择有密切联系，有时甚至二者是需要同时决定的。最后可根据目的要求及所选择的标本确定具体制片的方法。一般讲，制片技术的方法虽然很多，但对某一材料来说可能多不是十全十美的。因此我们在制定计划时，不妨多采用几种方法，以便比较。同时也要注意经济原则。方法确定后，在计划中还需将所用的药品、用具等名称及数量逐一列出，然后在定出具体的工作
9、日程。制订试验计划需要比较丰富的知识和经验，所以在订计划之前，必须要阅读参考文献，深入钻研。初学者可在有经验的老师指导下制订出比较完善和精密的实验计划。 （四）日程与记录：制片是一个连续的过程，从标本的采集、固定、切片、染色到封藏为止，往往要连续几天，如果事前没有工作日程、就会造成混乱。除编排日程表外，还必须将工作过程中的实际情况连同日程表都详细的记载在记录本上。这样可根据结果检查实际工作中的问题所在，总结失败原因，也可以总结成功的经验。所以日程表和详实地记录对制片工作来说，是一件非常重要而且必须长期坚持的工作。这些记录不仅要详实，而且还要作为档案保存起来。表1-3制片记录表材料固定液、固定时
10、间冲洗脱水酒精时间透明1/2纯酒精+1/2二甲苯时间浸蜡包埋切片厚度染色封藏结果备注第二节 生物制片分类一、 生物制片的分类:（一） 切片法:1.徒手切片:尽量切薄,切一层细胞,此法多用于植物切片的临时观察。2.石蜡切片：4-12m厚，用石蜡浸透到组织中，并包埋组织，用旋转切片机把蜡块切成薄片。3.半薄切片：0.5-1m厚，用树脂包埋。用途:在光镜下观察尽量薄；为超薄切片定位，因为其制片技术和超薄切片一致。4.冰冻切片：使组织内部及周围的水份结冰，组织变硬，然后用切片机切成薄片，制成切片，此法制作步骤少，用时短，不经脱水和透明，故对脂类无影响。常用于临床快速病理分析。5.木材切片：10-20m
11、厚，很硬，需软化，用50%酒精：甘油=1：1软化几天，滑行切片机切。6.火棉胶切片：用火棉胶包埋组织，滑行切片机切成薄片，主要用于大块组织切片。（二）非切片法:1.整体装片法：对于小的动植物体或较大动植物体的一部分，不经切片而直接制成玻片的方法。如昆虫口器、水螅、藻类、植物叶、茎表皮细胞。2.涂片法：对于流动和半流动的材料，不能切片，而直接将材料涂成玻片标本，干燥后进行固定、染色及封固。如血液、细菌、骨髓。如图1-1。3.压片法：将一些柔软的材料置于载玻片上，盖上盖玻片，用一定的压力将标本压碎或压开，制成玻片的方法。如洋葱根尖染色体观察，果蝇唾腺染色体观察。4.伸展法：一些成膜状结构的标本，使
12、它展平放在载玻片上，撕开、展平制成铺片标本，待干燥后经固定、染色后制成玻片标本的方法。常用于疏松结缔组织、神经等柔软组织或肠系膜等薄层组织。如图1-2。5.磨片法：主要用于含有钙盐等矿物质，成份坚硬的材料，如脊椎动物的牙齿、骨等用磨石磨成薄片，再封固成玻片。如图1-3。6.分离法：为了观察研究组织或器官里的单个细胞或纤维的形状，必须设法使细胞与细胞间质分离，细胞便各自分离开来，再经染色制成玻片标本的方法叫分离法。一般分为化学分离法和撕碎法两种。如神经细胞分离装片，平滑肌细胞分离装片。 图1-1涂片法 图1-2展片法 图1-3磨片法第三节 石蜡切片石蜡切片过程：取材固定冲洗脱水透明浸蜡包埋切片贴
13、片脱蜡染色脱水透明封藏一、取材：（一）生物组织取材的注意事项：1.取材应遵循准确、典型、完整、适时的原则。2.研究正常结构应选取健全而又有代表性的部分取材，采取病理材料时，除取病理部位外，还应选取正常部位，以利于对照观察。3.取材前，要根据要求选择并配制好固定液，取材后，立即投入固定液中，以防组织自溶和腐败。4.切取材料时，刀必须锐利，动作要快且仔细，切割时切勿拉锯式的来回切取，镊取也应轻拿轻放，避免材料的损坏。5.取材要详细记录日期、采集地点、标本名称、取材部位、断面和所用固定液等。（二）植物材料的取材：1.固定前对材料要进行切割：原因：（1）为了固定更容易为保证下一步固定材料能迅速的杀生和固定，务必使各细胞立刻停止生命活动，而不使原生质有崩解的现象。普通应用的固定液对于植物体外表面的角质、木栓质等的穿透很慢，但对于被切割的表面，则穿透速度快很多。所以，我们在固定材料的时候，应将所需要的部分分割到最小块、段或片、以达到立刻杀生与固定的目的。（2）石蜡块也有一定限制，一般（5-6mm）。2.切割面一般分为两类：（1）横切面：使用刀横越根、茎的横断面
