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1、以DNA拓扑异构酶II为靶点的抗癌药物-依托泊苷（VP16）国际班-张权 学号：201218360326【摘要】：DNA拓扑异构酶II(Topoisomerase II, TOPO II)是一种真核生物生存所必需的泛酶,在几乎所有DNA代谢过程中发挥重要作用。TOPO II使一条完整的DNA双链穿过一个移过性的双链断口,从而导致DNA解结或解旋。本文主要介绍了TOPO II的特性和以依托泊苷(VP16)作为TOPO II毒剂对肿瘤细胞的作用方式及效果。【关键词】：抑制DNA合成；抗肿瘤药；TOPO II酶；依托泊苷(VP16)。抗癌新药的研究和开发是目前制药工业中最热门、也是投资最多的领域。人
2、类到目前为止已经获准上市的抗癌药物约为200种【1】。临床试验中的抗癌新药有860多个【2】。有关癌症的药物可大致分为：抗代谢类抗癌药、靶向作用于DNA的抗癌药物、微管抑制剂类和大环类抗癌药、蛋白和蛋白激酶抑制剂类抗癌药、新型抑制剂类抗癌药、激素类抗癌药、其他靶向抗癌药物、用于癌症新疗法的药物、癌症辅助疗法药物【3】。药物治疗癌症的方式均是通过抑制癌细胞的生理活动来达到消灭某一区域癌细胞的目的。为了正确杀死癌细胞，药物均有各自的特异性识别位点作为靶点将药物导向癌细胞。DNA的双螺旋结构和半保留复制保证了DNA 在进行准确地复制时, 将遗传物质正确地传给下一代, 同时保持核酸链的严整性。但是 D
3、NA 的双螺旋结构也为 DNA 的复制、转录、染色体的组织等各种代谢过程带来不便。例如, DNA 的高度螺旋化会阻碍DNA的复制和转录。为解决这一问题真核生物细胞演化出了DNA 拓扑异构酶(DNA topoisomerase, TOPO 酶) ,来解决在 DNA 代谢中出现的构象上的问题【4】。1、TOPO酶的特性及作用方式TOPO 酶通过在 DNA的核糖 - 磷酸主链上产生移过性的断裂而改变 DNA的拓扑结构。在这个过程中为了保持 DNA 的严整性,TOPO酶的酪氨酸残基与新产生的DNA末端通过转酯反应形成共价键;当另一 DNA链从缺口处穿过后,再通过逆向的转酯反应,恢复DNA的完整。TOP
4、O酶主要包括2类酶: TOPO I和TOPO II，二者具有某些相同和交叉的功能,起到功能互补的作用,同时也存在一些重要的区别【5】。TOPO I在 DNA双链上产生单链断裂缺口, 使另一单链从缺口处穿过, 因而TOPO I可以改变DNA超螺旋或螺旋化不足的情况。TOPO I对单细胞真核生物如酵母的生存并不是必需的, 但对高等生物的发育必不可少。TOPO II在DNA主链上产生双链断裂,而使另一 DNA双链从缺口处穿过,在这个过程中需要ATP提供能量。除了能完成所有 TOPO I的功能外, TOPO II还能在DNA复制完成后使相互交联的姐妹染色单体分开。此外,TOPO II还参与DNA 复制
5、、转录、重组、染色体的组织等过程, 是所有真核生物细胞的生存不可缺少的关键酶。由于肿瘤细胞具有快速增殖的特性,其TOPO II的含量及活性远远高于正常体细胞,因此抑制TOPO II活性能起到阻止肿瘤细胞快速生长增殖,进而杀死肿瘤细胞的作用。TOPO II通过在 DNA链上形成一个移过性的双链断裂,使遗传物质中负的或正的超螺旋解旋,还使分子内或分子间的DNA结解缠绕，从而改变DNA的拓扑结构。TOPO II的催化反应可分为六个相对独立的步骤【6】： 酶与 DNA 的非共价结合。 DNA 双链断裂,伴随着TOPO II的2个亚基分别通过转酯反应与 DNA 断裂处的5端共价结和。 DNA 双链从核酸
6、主链的断裂处穿过,完成转移。 断裂的DNA 通过逆向的转酯反应重新连接。 与酶结合的ATP水解。 酶周转, 即TOPO II回到能重新启动催化反应的状态。在反应中,巨大的酶结构伴随着DNA双链的移动而重新定位, TOPO II的整个催化反应在 ATP水解的情况下才能完成。2、作用于TOPO II的药物选择方向针对TOPO II 与DNA之间的反应，可以选取不同的药物作用方式。1、选取可以与DNA结合的药物使之将DNA包裹，占领TOPO II与DNA的结合位点，使酶无法与DNA非共价结合。2、选取与DNA断裂处的5端具有高度相似性的物质作为药物，诱使TOPO II与药物结合，降低酶-DNA产物的
7、含量。3、选择能够稳定反应中间产物的物质作为药物，达到抑制整个反应的目的。4、应为反应中需要与酶结合的ATP水解提供能量，所以可以选择能占领ATP与酶结合位点的物质作为药物来抑制反应所需能量的提供。5、选择一种能诱使反应后的TOPO II水解的物质作为药物，阻止TOPO II酶与DNA的循环反应。6、选取可以抑制TOPO II的催化功能的药物。7、 选取“TOPO II毒剂”即可以抑制TOPO酶-DNA复合物进一步分解的物质作为药物，使得细胞中的复合物浓度升高，从而导致细胞基因组DNA均保持为双链断裂状态，从而导致细胞变异或是启动一系列导致细胞死亡的事件。3、TOPO II是TOPO II毒剂
8、细胞毒作用的靶点研究表明,TOPO II是TOPO II毒剂细胞毒作用的靶点。首先,细胞对以TOPO II为靶点药物的敏感度是其TOPO II生理水平或活性的反映【7】。如果细胞内TOPOII水平下降,则表现出对TOPO II毒剂的耐受；反之，TOPO II水平较高的细胞对这类药物高度敏感。其次，如果TOPO II的突变体在体外表现出对TOPO II毒剂的抗性,含有这种突变体的细胞对TOPO II毒剂也不敏感【8】。Nitiss等【9】建立的一系列酵母模型可以作为很好的工具来研究细胞对以TOPO II为靶点的化合物的敏感性或耐受性。通过在这些酵母株的TOPO II上引入点突变,从而使细胞表现出
9、对TOPO II抑制剂高度敏感或者耐受。应用这一系统已经证实了TOPO II的确是TOPO II毒剂的细胞内作用靶点。4、TOPO II毒剂研究及临床应用表明依托泊苷( Etoposide,(VP16) ) 和阿霉素(Adriamycin, ADM)可作为TOPO II毒剂作用于小细胞肺癌、淋巴瘤等恶性肿瘤。喹诺酮类如CP-1 15953是迄今为止惟一报道对真核和原核生物TOPO II均有作用的化合物。TAS-103【10】，S16020-2【11】，Bisantrene类 似 物【12】，intoplicine(茚托利 辛)【13】等是近年来发现能捕获可切割复合物的抗癌剂。研究发现紫杉醇也有
10、类似 T OPO II毒剂的作用, 而且作用方式独特, 在低浓度时 抑制 T O PO II的解旋，而在高浓度时却促进其解旋【14】。 5、TOPO II-药物-DNA三聚复合物的形成途径DNA断裂以及随后的细胞死亡的必要条件是首先要形成TOPO-药物-DNA复合物。这一三聚复合物的形成有以下3条可能途径【5】:药物首先与DNA相互作用而成为三聚复合物的一部分。药物特异地与TOPO-DNA二聚复合物结合,而与TOPO或DNA单独作用甚微。药物通过与酶结合而进入三聚复合物。6、依托泊苷( Etoposide,(VP16 )抗癌症的原理及过程6.1 TOPO II-依托泊苷( Etoposide,
11、(VP16)-DNA三聚复合物的形成方式及影响依托泊苷(VP16)【15】与TOPOII作用的研究则表明,许多抗癌药物主要通过途径,即直接与TOPOII相互作用。虽然以TOPOII为靶点的化合物几乎都能与DNA结合,但这是大多数药物的共同特征,因此认为该类药物并不参与可切割复合物的形成。研究发现, 依托泊苷(VP16)与TOPOII预孵育后所产生的DNA断裂远远大于与DNA预孵育后产生的量【16】因此,基于对依托泊苷(VP16)的研究证实这一非共价结合的三聚复合物主要通过药物与酶相互作用而形成的。由于这一过程是通过依托泊苷(VP16)与TOPO II相互作用,提示三聚复合物形成的位点主要由酶对
12、这些位点的特异性决定。一旦三聚复合物形成,此复合物从非共价结合到共价结合的过渡主要由依托泊苷(VP16)改变DNA序列结构的能力决定。因此，依托泊苷(VP16)诱导的在某一特异TOPO II切割位点的DNA断裂程度由在此位点上三聚复合物的浓度以及依托泊苷(VP16)对于DNA断裂/再连接平衡的影响决定。6.2 依托泊苷(VP16)对DNA断裂/再连接平衡的影响由于TOPO II与其催化循环中产生的断裂DNA共价结合,这一中间产物不会被酶释放出来,因此改变反应温度、增加反应体系的盐浓度或螯合反应所必需的二价阳离子均可使DNA断裂/再连接平衡向再连接方向移动。依托泊苷(VP16)以1种并不相互排斥
13、的方式促进TOPO II介导的DNA断裂，之后主要抑制TOPO II重新连接断裂的DNA的能力。6.3 依托泊苷(VP16)对肿瘤细胞的特异性及作用结果如果细胞内TOPO II水平下降,则表现出对TOPO II毒剂的耐受;反之,TOPO II水平较高的细胞对这类药物高度敏感。由于肿瘤细胞具有快速增殖的特性,其TOPO II的含量及活性远远高于正常体细胞，因此依托泊苷（VP16）会以肿瘤细胞作为受体细胞而以其中的TOPO II作为作用靶点，依托泊苷（VP16）对正常细胞的作用效果则会很小。依托泊苷（VP16）通过促进TOPO II介导的DNA断裂，之后抑制TOPO II重新连接断裂的DNA的能力
14、致使细胞基因组DNA发生双链断裂,从而导致细胞变异或是启动一系列导致细胞死亡的事件。7、结语与展望自从TOPO II被发现以来,医学家已经充分认识到TOPO II在DNA代谢、染色体重组和细胞分裂过程中具有重要的作用。TOPO II已成为抗癌药物细胞内重要的作用靶点。另一方面,尽管对TOPO II的认识有了进步,但是仍有许多问题需要深入研究和探讨。7.1 TOPO II毒剂对TOPO II的准确作用点Nitiss等【9】建立的酵母模型已经证实了TOPO II的确是TOPO II毒剂的细胞内作用靶点。但在哺乳动物细胞中,TOPO II 可分为TOPOII 和。TOPOII 在快速增殖的细胞中大幅
15、度提高,TOPOII 则不随细胞生长状态而发生明显变化。因此可以推断出TOPO II 同型是TOPOII毒剂的主要靶点，且在体外实验中, 同型比同型对活性化合物更为敏感。在用尼泊苷(teniposide,VM26)作用时,TOPOII 优先与新合成的DNA结合。但有研究显示,几种组织培养系对TOPOII毒剂的敏感性与细胞内TOPOII 的浓度相关。因此, 不能确定抗癌药物的靶点是否只是TOPO II某一同型。7.2 TOPO II毒剂与TOPO II抑制剂之间的关系TOPO II 抑制剂与TOPO II毒剂具有不同的化学式，其作用机制也不同。TOPO II催化抑制剂作用的步骤为：抑制TOPO
16、II与DNA的结合,通过阻断酶与其底物DNA的接触,可以削弱酶的功能。抑制TOPO II的催化功能。不仅抑制TOPO II的催化功能而且稳定反应的中间产物，如ICRF-193。ICRF-193与TOPO II毒剂作用方式有相同之处，即两者都能捕获中间产物，进而导致细胞变异、自我毁灭。TOPO II抑制剂可能对TOPO II毒剂起抑制作用。对于TOPO II抑制剂对TOPO II的抑制作用是否有抗肿瘤作用难以确定因为许多有TOPO II催化抑制功能的药物只有很弱的细胞毒作用,而惟有TOPO II毒剂才有明显的抗肿瘤活性。随着对TOPO II生理功能的逐渐了解,以及对以TOPO II为作用靶点的药物作用机制研究的不断深入,我们将能得到特异性更高、作用更强、不良反应更小的TOPO II抑制剂,为肿瘤治疗提供更合理、更有效的方案。【参考文献】
