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1、实验七 酱油中的氨基酸含量测定一、实验原理酱油是千家万户最常用的调味品，它是由提取食用豆油后的豆粕或豆饼经米曲霉发酵而成，优质酱油为赤褐色、鲜艳、透明、无沉淀。米曲霉可分泌到胞外许多水解酶，如蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，以及一些氧化酶等，使酱油产生特有的色、香、味，它的色是由于一些糖（如五碳糖）和氨基酸（如色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸）的一些基团与氨基置换或氧化反应，产生的一些类黑色素。香气主要成分是4-乙基愈创木酚和4-羟基-2乙基-5甲基呋喃酮等。此外，还有醇、醛、酯和有机酸成分产生的。它的味主要是氨基酸，特别是谷氨酸，其次是缬氨酸、天冬氨酸等，如每100ml日本万家酱油含有1270mg谷氨酸，我
2、国的一级酱油含500mg谷氨酸，三级酱油含260mg谷氨酸。本实验用聚酰胺薄层层析，在乙酸溶液中展层，再用茚三酮显色，以标准谷氨酸为对照，观察不同酱油中的氨基酸的含量变化，在一定程度上它反应了酱油的质量。聚酰胺薄板是由聚合是氨基己酸H2N(CH2)5COOH,俗称尼龙6，或聚合的己二胺H2N(CH2)6NH2和己二酸HOOC(CH2)4COOH,俗称尼龙66,用甲酸溶解，均匀涂在胶片片基上而成。样品在乙酸溶液中展层,由于不同分子极性不同,分配层析速度和位置不同而分开。展层后，谷氨酸的位置靠近前沿。可看到不同品质酱油中谷氨酸含量不同，学生可自取家中酱油,相互比较产品的质量。二、 实验目的了解茚三
3、酮测定氨基酸含量的原理及方法。三、实验材料与仪器1、 实验材料：燕京酱油，李锦记老抽，海天老抽，加加老抽，美味鲜酱油。2、 实验器材：烧杯、培养皿、聚酰胺薄膜、移液器、吸头、一次性手套四、试剂配制（1）茚三酮溶液：取100mg茚三酮，用10ml乙二醇甲醚溶解，溶液在暗处保存。（2.）标准谷氨酸钠溶液：取10mg谷氨酸钠溶至1ml水中。（3.）展层剂：水:冰乙酸（V/V）=20 : 0.3（4）酱油：按1：30稀释五、实验前准备主要仪器：喷壶25个/班，1个/组；吹风机25个/班，1个/组辅助仪器：烧杯25个/班，1个/组；培养皿25个/班，1个/组耗材：聚酰胺薄膜25张（8*8cm）/班，1张
4、/组；吸头-10ul 125个/班，5个/组；一次性手套25双/班，1双/组药品试剂：展层剂4200ml/班，168ml/组；茚三铜溶液250ml/班，10ml/组；标准谷氨酸溶液5ml/班，0.2ml/组六、实验方法及步骤 1. 取1张88cm的聚酰胺薄膜，在不光滑的面上，在距一边1cm的位置上，相隔1.5cm用玻璃毛细管（或用10ul移液器枪头）取不同种的酱油及标准氨基酸分别点样，点样直径不超过1.5mm。等第一次点样风干后，再点第二次，共点样两次。2. 在烧杯中加入展层剂。展层剂乙酸溶液高度不超过0.8cm。将点样的聚酰胺薄膜放在烧杯中展层。展层时，烧杯上盖上培养皿，使展层剂不易扩散至室
5、内空气中,且在容器内形成溶剂的饱和蒸气压。当展层剂前沿接近薄膜边缘时取出，用热风吹干。3. 将茚三酮溶液喷至薄膜上（或将少量茚三酮溶液倒入小培养皿中，展层后的薄膜速浸速取），再用热风吹干。观察蓝紫色斑点，即为酱油中不同种的游离氨基酸。七、实验结果与分析1.1号为谷氨酸钠标准溶液，2-7号为酱油样品。照片中出现蓝紫色斑点处即为谷氨酸聚集处。2. 由图片可以看出，样品中4号颜色最深，其中所含的谷氨酸钠也应是最多，其他含量由多至少依次是7，5，3，2，6。八、注意事项及改进1.点样时的面积一定不可太大，因此可以定量点样，每次取4微升点样，可以避免出现这种情况。2.展层时要密闭展层容器，以免展层剂挥发
6、影响实验效果。3.要等到展层液接近薄膜边缘时再取出。4.聚酰胺薄膜浸入茚三酮溶液的时间要短，否则氨基酸会溶在茚三酮溶液中无法显色。5.吹干时，要垂直吹干，否则会出现氨基酸飘移的现象。6.茚三酮有毒，实验中要注意不要直接接触皮肤。7.为了避免手直接碰触聚酰胺薄膜而影响试验结果，在试验过程中要戴一次性手套。8。点样量大时有拖尾现象；点样量小又会层析物质颜色太淡。因此，可在试验中选择合适的点样量。九、问题与讨论1在生物化学中各种层析基于哪三种原理，它们是：A分配层析 B. 吸附层析C交换层析 D. 逆流层析E电子层析 F. 柱层析答:A、B、C2亲和层析在原理上应属于哪一类层析? A.专一的离子交换
7、层析 B.专一的吸附层析 C.专一的分配层析 D.与载体吸附 E.与配基吸附 F.与臂吸附 答:B、E3. 用于蛋白质凝胶电泳后,多用考马斯兰染色,在用有机溶剂脱色后,有色的有机溶剂溶液若从新用于脱色,需将染料从有机溶剂中去除,用下述什么柱过滤可将染料吸附? A.硅藻土 B.活性炭 C.人造沸石 D.Sephadex G-25 答:B4.在薄层析中表明某物质从起始点(原点)移动到达的位置有一个测定值叫比移值(Rf值).Rf值定义为: A.展层后某物质(斑点)所在位置的中心与起始点间的距离/起始点与溶剂前沿间的距离 B.起始点与溶剂前沿间的距离/展层后某物质(斑点)所在位置的中心与起始点间的距离 C斑点中心与溶剂前沿的距离/起始点与溶剂前沿的距离 D起始点与溶剂前沿的距离/斑点中心与溶剂前沿的距离 答：A5影响Rf值的因素有: A.溶剂的性质 B.溶剂的组分 C.介质的性质 D.介质的厚度 E.层析室溶剂的饱和度 F.样品中杂质的多少 G.展层的距离 H.上样量 I.温度 J.展层剂pH值 答:AJ.十、建议课时安排实验完成需要35min，建议1个课时。
