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1、重组水蛭素的聚乙二醇修饰李雪芹，候蓓蓓，赵军，田明玉，修志龙*大连理工大学环境与生命学院 大连 116024摘要：目的 水蛭素因血浆半衰期短而严重限制了其临床应用，聚乙二醇修饰能有效地延长其半衰期。本文通过比较不同修饰位点、修饰方法所得单修饰产物的比率、纯度及其活性保留率，从而得到修饰专一性强且活性保留率较高的修饰策略。方法采用液相和固相修饰方法,用琥珀酰亚胺活化的PEG 20kDa分别在pH6.0、8.0的条件下对水蛭素的His和Lys进行定点修饰；用SDS-PAGE分析产物的修饰度，并用离子交换柱对修饰后的产物进行分离，然后用凝血酶滴定法测定水蛭素单修饰产物的体外抗凝活性。另外用分子动力学
2、模拟方法预测了pH8.0条件下PEG修饰的位点。结果 在pH6.0、8.0的条件下，水蛭素单修饰率都高达90%以上，但二者的单修饰活性保留率相差较大。在pH6.0时，液、固相单修饰活性保留率为34%、34.8%；而在pH8.0时分别为55%、96%。结论 在pH8.0 条件下，采用 “离子交换柱辅助”固相修饰的方法对Lys进行定点修饰能得到较高产率和较高活性保留率的单修饰产物。关键词：重组水蛭素；SC-mPEG；抗凝活力；分子动力学模拟 PEGylation of Recombinant HirudinLi Xueqin，Hou Beibei，Zhao Jun，Tian Mingyu，Xiu
3、Zhilong*Department of Bioscience and Biotechnology,School of Environmental and Biological Science and Technology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,ChinaAbstract: OBJECT Hirudin is the most potent inhibitor of thrombin found in nature. Although hirudin has the strongest anti-thrombin acti
4、vity in vivo, its short half-life in serum significantly limits its clinical anticoagulant application. Currently, PEGylation is commonly used as an effective method to prolong its half-life in serum. Our object of experiment is to choose the best PEGylation method according to the monoPEGylated rec
5、ombinant hirudins purity and the anticoagulant activity in vitro. METHODS Solution method and solid method assisted by “packed-bed” and anion exchange column were used to favor the formation of mono-PEGylated hirudin. The mild acidic and mild alkaline PEGylation strategy was used to target His resid
6、ue and Lys residue of hirudin respectively using SC-mPEG 20kDa. The pegylated products were isolated by anion exchange chromatogram. SDS-PAGE was used to analyze the purity of PEGylated hirudin. Thrombin method was used to analyze the anticoagulant activity of PEGylated hirudin. Molecular dynamics m
7、odeling was used to judge the probability of PEGylation site. RESULTS The mono-PEGylated product with a purity of more than 90% was obtained at pH6.0 and pH8.0. But a large difference in anticoagulant activity exists: the anticoagulant activity of solution and solid methods were 34% and 34.8% respec
8、tively at pH6.0；55%、96% at pH8.0. CONCLUSION Solid method assisted by anion exchange column at pH8.0 was a better strategy to get mono-PEGylated r-Hirudin.Key words：recombinant hirudin；SC-mPEG；anticoagulant activity；molecular dynamics modeling前言 水蛭素是含65个氨基酸残基与3个二硫键的多肽，分子量约7000，是迄今为止发现的特异性最好的凝血酶抑制剂1,
9、而凝血酶诱发的血液凝固是诱导血管血栓形成的重要原因，因此水蛭素对各种血栓病均有疗效。然而水蛭素有一些显著的药用缺点，如血浆半衰期较短，一般只有60-100分钟，患者需不断注射才能维持抗凝效果，导致治疗成本较高，且重复注射也会引起一些不良反应2-4。上世纪70年代以来，人们发现一些蛋白经过PEG修饰后，很多方面的药用特性大大改善。之后，人们开展了对于水蛭素的PEG修饰研究。George C.Avgerinos5等人采用基因工程方法对水蛭素氨基酸进行改造，用甲基营养酵母 Hansenyla polymorpha特异性表达了只含两个Lys的水蛭素，采用对硝基碳酸酯活化的PEG 5kDa进行修饰，并设
10、计了工业等级纯化步骤。这种对水蛭素修改的方式可以大大提高修饰产物的专一性，但是研究周期性较长且须具备一定的科研条件。国内也有关于水蛭素PEG修饰的研究。于爱平6等人采用SPA-PEG 5kDa修饰水蛭素II，采用Source Q15离子交换柱凝胶柱分离修饰产物，发现三修饰产物活力大大降低，为原蛋白的33.5%。秦海娜7等人采用羰基二咪唑法活化的PEG 5kDa修饰水蛭素，采用凝胶色谱方法崔修饰产物进行分离，虽水蛭素可与修饰产物分离，但是修饰产物之间未能分离开。本实验组旨在通过比较不同修饰位点、修饰方法所得单修饰产物的比率、纯度及其活性保留率来找到修饰专一性强且活性保留率较高的修饰策略。修饰位点
11、选择了His和Lys；修饰方法选择了液相修饰和 “填料辅助”、“离子交换柱辅助”两种固相修饰方法。1 材料 基因工程重组水蛭素（r-Hir）购自大连高新生物制药有限公司；水蛭素变异体2购自重庆科润生物医药有限公司；SC-mPEG 20kDa购自北京键凯科技有限公司2 实验方法2.1 水蛭素His位点的PEG修饰2.1.1液相修饰 HV2与SC-mPEG 20 kDa以摩尔比 1:1 溶于0.2M pH6.0磷酸盐缓冲溶液中（PBS），在25中反应1.5h。反应产物用HiTrap Q HP进行线性梯度洗脱。2.1.2“填料辅助”的固相修饰在pH6.0下，将20mM PBS与r-Hir: SC-m
12、PEG以摩尔比1:3在Q-Sepherose FF介质中充分反应，反应完成后装柱、梯度洗脱。2.2 水蛭素Lys位点的PEG修饰2.2.1 液相修饰 HV2与SC-mPEG20 kDa以摩尔比 1:3 溶于0.02 M pH8.0 PBS中，在23下反应。SC-mPEG分三等分三次加入，每次反应30min。反应结束后样品立即用HiTrap Q HP进行线性梯度洗脱。2.2.2 “离子交换柱辅助”的固相修饰 4 ml 1.5mg/ml HV2 溶液 (溶于PBS 20 mM, pH 8 A液）与溶于4 ml 20 mM, pH 8 PBS 中的 SC-mPEG先后以1 ml/min的流速上样于柱
13、中，使二者在柱中充分反应后进行在线梯度洗脱。3 分析方法 3.1 SDSPAGE参考文献8，15%浓缩胶、4%分离胶，采用含5%氯化钡的0.1M碘液对PEG进行染色。表1为水蛭素PEG各修饰产物的理论分子量，可结合电泳图确定洗脱组分成分。表1 水蛭素PEG修饰产物组分理论分子量Table 1 The estimated molecular weights of the PEGylated hirudin 3.2 生物活性测定参照文献9的方法，采用凝血酶滴定法。3.3 组氨酸修饰产物含量检测利用SC-mPEG与r-Hir的His残基之间形成的氨基甲酸酯键对于中性羟胺的敏感性测定组氨酸修饰位置异构
14、体的含量。3.4 Lys修饰位点预测采用溶剂可及表面积作为判定赖氨酸残基修饰可能性的判断标准，运用分子动力学模拟的方法分析和预测液相和固相修饰的位点。4 结果4.1 水蛭素His位点的PEG修饰4.1.1 液相修饰 4.1.1.1 修饰产物的分离纯化液相方法制备的PEG化水蛭素采用离子交换柱进行分离纯化、SDS-PAGE法进行组分鉴定。图1 阴离子交换色谱分离修饰反应混合物（pH6.0）Fig.1 Separation of the PEGylation mixture (prepared at pH6.0) by anion-exchange chromatography 图2 修饰产物的电
15、泳结果（15%-5%）Fig. 2 SDS-PAGE analysis of PEGylated r-hirudin.结合表1、图2可以推测出图1中峰 1，2 ，3分别为二修饰产物、单修饰产物、单修饰产物。通过积分法计算出图1中各峰的面积，从而得出出各产物的比例：峰1：峰2：峰3= 4.74%：94.6%：0.66%，可见单修饰产物是主要的修饰产物。4.1.1.2 单修饰产物的体外抗凝活性测定采用凝血酶滴定法对修饰水蛭素进行活性检测。图3 重组水蛭素以及单修饰重组水蛭素的体外抗凝活性测定Fig. 3 In vitro anticoagulant activity of r-hirudin and monopegylated r-hirudin 图3显示峰2相对于未修饰的r-hirudin其抗凝活性保留率为34%, 而峰3的抗凝活性保留率为19.2%。峰2具有较高的抗凝活性保留率，并且是修饰反应的主产物（峰2占修饰反应产物的94.6%）,因此被选作本文的目标单修饰产物做进一步的分析。4.1.1.3 His-修饰位置异构体含量测定利用SC-mPEG与r-Hir的His残基之间形成的氨基甲酸酯键对于中性羟胺的敏感性测定组氨酸修饰位置异构体的含量。图4 组氨酸修饰位置异构体含量测定Fig. 4 The p
