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1、生物质转化酶的改进：一个基本的研究视角论文翻译Improving Enzymes For Biomass Conversion: A Basic Research Perspective生物质转化酶的改进：一个基本的研究视角班纳吉1，约翰S斯科特-克雷格1和乔纳森D.沃顿1 （1）能源部大湖生物能源研究中心，植物研究实验室，密歇根州立大学，东兰辛，MI 48824，USA Jonathan D.沃顿的在线发布时间：2010年1月9日抽象植物生物质原料转化为可发酵糖酶的成本是一个实用的纤维素乙醇产业发展的一大障碍。私人产业界，学术界和政府实验室正在积极追求的目标降低成本的材料，如玉米秸秆生物质转
2、化成葡萄糖，木糖，和其他糖酶优化研究。部能源大湖生物能源研究中心的主持下，我们采取几种方法来解决这个问题，包括优越的关键酶，蛋白质工程，在植物中表达和高层次的“生物勘探”。一个特别的重点是发展合成酶的混合物，以了解已知的酶的数百重要在什么比例。一组核心包括切纤维素酶，内切葡聚糖-葡萄糖苷酶，木聚糖酶和-葡萄糖苷酶。配件的酶包括酯酶，蛋白酶，非水解蛋白质和糖基水解酶，裂解不太频繁的植物细胞壁中发现的化学联系。关键词 纤维素 半纤维素酶 木聚糖酶 氨纤维膨胀 玉米秸秆 生物能源 木糖苷酶，葡萄糖苷酶，纤维二糖水解酶 内切葡聚糖酶 木霉 曲霉介绍从木质纤维素材料液体运输燃料被看作是一个重要的潜在替代
3、石油 35 。预计纤维素乙醇有利于温室气体的分布，减轻对外国石油的依赖，弥补全球石油储量减少，并提供了一个经济的推动作用 16 。最受欢迎的木质纤维素生物质转化为乙醇或其他液体燃料的战略涉及多糖的酶催化的解聚反应。然而，酶本质上是昂贵的，因为它们必须产生的生活系统，在热力学上是不稳定的。由于木质纤维素的化学和物理顽抗，酶负荷高降解率是必要的，以合理的。酶的最终成本是阻碍发展的一种经济可行的纤维素乙醇产业 40 的主要开支之一。生物质转化酶生物化学和植物木质纤维素材料的化学和微生物酶，解聚，经常被评论 12，40，58 。它提醒读者的木素纤维素材料转化为可发酵糖的速率和效率的函数开始的生物质材料
4、，预处理，介于6至60的酶活性的参与，和的定义中的“可发酵糖” 。不同的原料（木材，玉米秸秆，甘蔗渣等）受到不同预处理含有不同浓度（变量）不同的糖。考虑到所期望的最终产品的解聚，野生型的酿酒酵母（酵母）发酵葡萄糖但不木糖，而木糖和纤维寡糖是可以接受的其他天然或工程微生物 28，51 。因此，生物质源，预处理，酶混合物，发酵微生物是相互依存的变量。从研究最为透彻的酶系统的角度来看，结晶纤维素的解聚作用的心脏包括纤维二糖水解酶（CBH），内切1，4 -葡聚糖酶（EG）和-葡萄糖苷酶（BG）。半纤维素分解的酶学我们的知识是那么广泛。而纤维素是化学均匀，可在高纯度的形式，半纤维素比较丰富，植物物种和组
5、织之间在一个单一的工厂。双子叶植物的半纤维素，例如，含有岩藻糖，O-乙酰化的半乳糖，1，6 -木糖取代的1，4 -葡聚糖 10，19，46 。酶活性，有必要在双子叶植物的半纤维素降解的联系，因此，包括1，4 -葡聚糖酶（可专门用于半纤维素，例如木葡聚糖），-岩藻糖苷酶，-葡糖苷酸酶，1,4-木聚糖酶，-和-木糖苷酶，-阿拉伯糖苷酶和酯酶的几类。果胶是解构果胶裂解酶，果胶酶，果胶,甲基酯酶，以及复杂的果胶（如鼠李II）的情况下，可能是其他酶。对比草本双子叶植物，谷类中含有较低水平的果胶，更高水平的glucurononoarabinoxylan，和酯化的酚醛树脂。这些成分的解聚的木聚糖酶，1，2
6、-和1，3 -阿拉伯糖苷酶，-葡糖苷酸酶，和酯酶 55 。谷物也含有的混合联动葡聚糖（MLG），局部地区发现高浓度的一些组织，如幼苗和胚乳墙。后者是干燥酒糟（DDG）的主要组成部分，玉米淀粉乙醇生产的副产品。MLG水解的一些常规的纤维素酶（即，1，4 -葡聚糖酶），也可以由专门的酶（称为混合联葡聚糖酶，-葡聚糖酶，或地衣酶）。除了 直接作用于植物细胞壁多糖的共价键的酶，间接发挥作用的酶，也可能是重要的纤维素分解。这种酶有三类。第一个非酶蛋白质，有助于墙松动，如膨大和真菌和细菌的同源物 52 。第二组，可能会对间接关键酶是那些降解非糖苷的壁部结构构件，如木质素和蛋白质，从而便利的糖基水解酶 44
7、 。第三组可能是潜在的重要的辅助酶降解的小分子物质，预处理释放，抑制降解酶的核心或下游发酵步骤 6，7，31 。生物酶的研究景观目前生物质解构（以及对于大多数其他工业应用）的酶是来自于真菌，特别是木霉属的物种（其有性阶段被称为肉座菌属）和曲霉（有性阶段翘孢霉属）的。一些酶制剂，主要用于食品加工，从有丝分裂的子囊菌腐质霉属或从种芽孢杆菌的细菌，如。20世纪50年代以来，里氏木霉已遭受多轮菌种改良增强纤维素酶生产 41 。减少降解物阻遏来自增强的纤维素酶生产 23 ，减少蛋白酶的活性 42 ，简单的营养原料和廉价的纤维素酶诱导剂的高密度的方法来种植木耳的发展。目前蛋白生产T. 里氏木霉据报道，接近
8、100克/升，并要求最小的后发酵处理。最突出的方面，目前的研究环境对生物酶是其集中在私营部门，尤其是在两个主要的工业酶制剂公司，杰能科和诺维信。这种状况，明确支持在美国能源署（DOE）的生物能源研究的主要资助者。在过去的10年中，已经有两个大的方案，在这些和其他酶公司资助研究。2001年，诺维信和杰能科赠款15亿美元和17亿美元，分别。这笔资金已经指出，导致20 - 30倍，减少酶的成本生产乙醇酸处理玉米秸秆 53 ;http:/www.nrel.gov/awards/2004hrvtd.html？打印 。但是，这些数据还没有被发表在同行评审期刊，因此，这种说法无法进行验证。在接受记者采访时发
9、表于2009年6月，诺维信的发言人给酶的目前成本“约为1美元/加仑” 9，这意味着联邦政府资助的研究之前的成本是20-30美元/加仑。显然，在这方面有很大的不确定性。2008年，新一轮3380万美元的资金用于酶研究分布在四家公司诺维信，杰能科，帝斯曼创新中心，Verenium公司（http:/www.energy.gov/print/6015.htm）。诺维信和杰能科是丹麦公司，总部设在荷兰帝斯曼创新。这笔资金上的合作伙伴包括三个能源部国家实验室（NREL，西北太平洋国家实验室和桑迪亚国家实验室）和阿文戈亚生物能源新技术（一家西班牙公司）。2008年美国能源部提案征集的一个重要特点是要求所有得
10、奖使用稀酸处理玉米秸秆作为实验原料。酸预处理能够溶解大多数植物细胞壁中，被丢弃的（从而失去了一个显着的碳量），或中和，并重新加入到不溶性级分（主要是纤维素），或独立地进行处理的半纤维素。从效率的角度来看，这些战略都没有理想。有几种技术，是强有力的竞争者，成为未来的预处理方法的选择（例如，离子液体和碱性化学品的几种类型的）。酶的混合物，将需要为每个被重新优化。虽然不能否认它的主要酶公司有巨大的工业酶制剂在各方面的专业知识，有这么多美元的投资在他们现有的研究有两个潜在的缺点。首先，大小在一个特定区域的生物能源研究的补助金，使人们难以对其他实验室的竞争（即小公司，大学，和美国能源部国家实验室的几十万
11、美元被认为是重要的资金，场地）。其次，酶公司没有义务公布其结果，其实这是不符合他们的最佳利益，因为其知识产权作为商业秘密（也就是说，即使在专利文献中披露）举行。已经进入了公共部门的数据非常少，导致从美国能源部的资金（2001年）的第一轮和第二轮（2008年）的结果，也可能会受到严密举行。缺乏问责制，同行评审，或公共访问可以合理地预期，作为一个强大的克制纤维素乙醇未来在这个关键领域的进展。这笔资金的情况，甚至不知道公司所追求的实验途径，简单的存在可以推定有窒息作用，对其他地区的研究。有关的酶被美国能源部资助私营部门进行的研究，我们知道什么？根据新闻稿，专利，在科学会议上举行会谈，以及散布在英特网
12、上的演示文稿，公司正在采取多种方法来降低成本的酶。这些措施包括筛选新的生物（主要是真菌）的高级版本目前酶和酶与现有的商业酶协同作用，继续通过常规和分子诱变，通过蛋白质工程和定向进化，酶改善和效率改善工业菌种改良规模产酶 1，11，40，48，49，56 。目前的策略，以提高酶这是一个给定的酶是太昂贵。为降低成本10 - 100倍的潜力是什么？像任何工业的过程中，降低成本可以来自工程和营销解决方案，如更节能发酵罐或发酵副产品销售。在这里，我们将讨论限制考虑降酶成本，涉及的微生物或酶的操纵方式。只要酶的蛋白质质量的基础上销售，这些策略的总体目标是增加的比活性的混合物，获得相当于发酵糖产量较少的蛋白
13、质。应变方面的改进，T. 里氏木霉已经进行了广泛的改进。这是很难看到蛋白质如何产生大于100克/升，可以实现。然而，进一步改善菌株可能集中在剪裁的蛋白质比例，特别是生物质基材/预处理组合或由遗传消除分泌酶是没有必要的。如果真菌发酵成为酶降低成本的限制因素，在其他系统中的酶的生产是可能的。农业提供了巨大的植物蛋白质，每亩的产量。已产生一些细胞壁降解酶在植物中，例如，细菌内切葡聚糖酶和真菌纤维二糖水解，几个初创公司是基于这一技术 22，64 。酶可以一起产生在一个单一的植物，或单独，与现有技术的可溶性蛋白萃取。可以有针对性的质外体酶，空泡，或质。可以调节酶的基因，使他们的表达的响应无偿诱导剂，或在
14、一个特定的发育阶段，例如，在衰老 58 。另一种策略，以提高产生了很大兴趣的酶是蛋白质工程。在该策略中的一种酶的三维结构引导的氨基酸残基，如特定的活动或热稳定性影响的某些属性的识别和修改。一些证明原则研究表明，这种做法是可行的20，47，62 ，但目前尚不清楚最终成功，那是因为在特定的生物酶的活性理化限制不能很好地明白了。甲真菌CBH的特定活性高的在本质上不知道，也许是从未出现通过自然选择的过程中，因为它不只是为热力学可能。对酶行为进化的极限知名的例子包括低亲和力的二磷酸核酮糖羧化酶对CO 2的事实，只有少数微生物，几乎完全担子菌的真菌，已经演变降解木质素的能力 29 。此外，除了是必须考虑的
15、，但可以是困难的在体外测定的比活和热耐受性酶具有临界性质。例如，除了催化特定的化学反应，酶，必须有效地翻译和分泌，能够抵抗蛋白酶，与其他酶协同行事，并具有较低的产品和反馈抑制。人们可以很容易想象，一个“改良”的酶，根据模型上的衬底上的隔离检测，可能会表现不佳，在一个真实世界的情况 62 。考虑到自然选择进化的力量以惊人的性能和大量的蛋白质和微生物的代谢多样性高，许多研究人员已经把探索更好的酶的性质。这种“生物勘探”可以或多或少随机的，或进化或生态的原则可以遵循。它可以采取隔离微生物生长生物质基材，采矿数据库已知的酶基因的克隆变种的基因组测序，通过聚合酶链反应（PCR），或寻找新的基因，通过宏基
16、因组学的形式。一种方法利用随机克隆到表达宿主，所产生的转化，然后被筛选直接在板中含有纤维素或其他模型生物量基板（D米德和P Brumm，Lucigen，公司，个人通讯）。可用于生物勘探寻找更好的替代已知的重要的酶或酶（例如，CBH和EG），增强（“协同作用”）与现有的商业纤维素酶的混合物。富有想象力的生物勘探是怎么回事，在许多学术，政府和私人实验室，探索不同的热带堆肥，白蚁肠道，蛀木蜂，和温泉生态龛。然而，尽管生物勘探和DNA测序技术便于广泛的吸引力，基因的发现是目前没有一个限制因素，在寻找新的，更好的酶。数以千计的基因注释为“纤维素酶”是已经存在的公共数据库中，还有数千新兴每月从高通量测序设施。相反，主要的限制因素，在目前和未来，是由这些基因编码的生化活动能力评估。不幸
