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1、紫色非硫光合细菌培养基条件优化的研究摘要:采用光合细菌中的紫色非硫细菌为材料,通过单因素试验和正交试验分析了其对碳源、氮源、酵母膏和复合无机盐的利用能力.结果表明,乙酸钠和酵母膏对紫色非硫细菌的生长影响达到显著水平;其优化培养基为每升中含乙酸钠3 g、氯化铵3 g、酵母膏0.1 g,复合无机盐溶液1 mL,这为快速培养高活性光合细菌奠定了基础.关 键 词:光合细菌;培养基优化;正交试验光合细菌(photosynthetic bacteria;PSB)是一种能以光作能源并以二氧化碳或小分子有机物作碳源、以硫化氢等作供氢体,行完全自养性或光能异养性生长但不产氧的一类微生物的总称1.它是细菌中最为复
2、杂的菌群之一,在自然界中分布极广,只要有水和光存在,不论其环境为好气性还是攘气性均能生存繁殖,是一种生命力极强的菌体2.目前所知的光合细菌可分为着色杆菌科、外硫红螺菌科、紫色非硫细菌、绿色硫细菌、多细胞丝状绿细菌、螺旋杆菌科、含细菌叶绿素的专性好氧菌等7大类群3.光合细菌菌体含有丰富的蛋白质、氢基酸、维生素、抗病毒活性因子、辅酶Q以及多种生理活性物质,其用途极为广泛4.在水产养殖和畜牧业上可以作为动物的优质饵料和饲料5;在污水处理上可以有效去除废水中的有机物、氮、磷和硫化物等有害物6;在农业上可以作为一种高效菌肥,对增进土壤肥力等方面有重要作用7.另外,最备受关注的是光合细菌具有产氢不放氧,且
3、产氢纯度高等特点,被认为是很有希望的绿色氢来源之一8.光合细菌的推广和应用,需要合适的培养基质,但目前用于培养光合细菌的培养基具有平均富集时间较长、培养基成分种类多以及成本较高等缺点,限制了光合细菌在生产上的广泛应用.为此,本文以光合细菌中的紫色非硫细菌为材料,对其培养基条件的优化进行了研究,为高活性光合细菌的推广应用提供理论基础.1 材料与方法1.1 菌种来源光合细菌)紫色非硫光合细菌由广西南宁助农种养技术服务部提供.1.2 培养基的制备优化培养基试验采用微生物学实验教程9中细菌培养基的基本配方,其组成如下:NH4Cl 1 g,丁二酸钠1 g,KH2PO40.2 g,MgSO4#7H2O 0
4、.005 g,Na2CO30.2 g,酵母膏0.1 g,复合无机盐溶液1 mL,水1 000 mL,pH=7.0.复合无机盐溶液组成为:EDTA 0.5 g,FeSO4#7H2O 0.2 g,ZnSO4#7H2O 0.01 g,硼酸0.03 g,MnCl2#4H2O 0.003 g,CaCl2#2H2O 0.02 g,NiCl2#6H2O 0.002 g,CuCl2#2H2O 0.001 g,Na2MoO4#2H2O 0.003 g,水100 mL,HCl调pH=3.0.1.3 接种选择菌种活性度大,即色泽呈凿红色,菌液中菌体分布均匀未见有下沉现象,光密度高的菌液选作菌液母剂.接种后35 d内
5、,若发现菌液转为红色较慢,或菌体发生下沉,说明其活性减弱,需重新配制培养基,选用活性较强的菌种进行接种.1.4 培养条件以质量浓度5%的接种量将菌种接种于300 mL小口试剂瓶中,在光照培养箱中8001 500 lux光照强度下厌氧培养,pH=7.0,温度30e,培养时间为5 d10.光合细菌培养可观察到其颜色随着时间变化为:无色粉红红色深红.一般在第2天时转为粉红色,第3、4天变为红色,到第5天即可达到深红,故本试验选择的培养时间为120 h.1.5 菌种光密度值测定经培养一定时间后的菌液,用721型分光光度计测定其在660 nm处的OD值即可得知细菌的生长密度,以此来判断菌种的生长状况.1
6、.6 碳氮源优化以蔗糖、淀粉、乙酸钠、柠檬酸钠4种碳源,分别替换培养基中的丁二酸钠配置培养基,以氯化氨、硫酸氨、蛋白胨、硝酸钠4种氮源,分别替换培养基中的氯化氨配置培养基.1.7 正交试验根据单因素试验的结果设计了4因素3水平(乙酸钠、氯化铵、酵母膏、复合无机盐)的正交分析表,试验设计如表1.表1 4因素3水平正交分析表处理号Q乙酸钠Q氯化氨Q酵母Q复合无机盐1 1(0.2%) 1(0.3%) 1(0.01%) 1(0.1%)2 1(0.2%) 2(0.4%) 2(0.03%) 2(0.2%)3 1(0.2%) 3(0.5%) 3(0.05%) 3(0.3%)4 2(0.3%) 1(0.3%)
7、 2(0.03%) 3(0.3%)5 2(0.3%) 2(0.4%) 3(0.05%) 1(0.1%)6 2(0.3%) 3(0.5%) 1(0.01%) 2(0.2%)7 3(0.4%) 1(0.3%) 3(0.05%) 2(0.2%)8 3(0.4%) 2(0.4%) 1(0.01%) 3(0.3%)9 3(0.4%) 3(0.5%) 2(0.03%) 1(0.1%)2 结果与分析2.1 不同碳源对菌种生长的影响以质量浓度均为0.1%的蔗糖、淀粉、乙酸钠和柠檬酸钠4种有机化合物分别作为光密度值为0.15紫色非硫光合细菌碳源,其对不同碳源的利用情况见表2.表2 不同碳源对菌株生长的影响碳 源
8、OD值培养时间/d蔗 糖0.17 5淀 粉0.23 5乙酸钠0.85 5柠檬酸钠0.78 5从表2中可以看出,紫色非硫细菌对不同碳源的利用存在较大的差异.其中紫色非硫细菌对蔗糖和淀粉的利用能力较差,而对乙酸钠的利用能力较好.同时,乙酸钠是一种价格比较便宜的化学试剂,因此采用乙酸钠作为紫色非硫细菌的碳源较为理想.#5#第1期钱森和,等:紫色非硫光合细菌培养基条件优化的研究2.2 不同碳源质量分数对菌种生长的影响图1为不同浓度乙酸钠对光密度值为0.10的紫色非硫细菌生长的影响.可以看出,适量的碳源促进紫色非硫细菌的生长,而过量的乙酸钠反而会抑制混合菌株的生长.选择质量分数0.3%的乙酸钠对其菌株的
9、生长较为理想.图1 不同质量浓度乙酸钠对菌株生长的影响图2 不同质量浓度氯化铵对菌株生长的影响2. 3 不同氮源对菌种生长的影响表3为光密度值为0.15的紫色非硫细菌对质量分数均为0.1%的氯化铵、硫酸氨、蛋白胨和硝酸钠4种氮源的利用情况.可以看出,氯化铵作为氮源最有利于菌株的生长,而硝酸钠作为氮源其效果最差,因此选择氯化铵为氮源较为理想.表3 不同氮源对菌株生长的影响碳 源OD值培养时间/d氯化氨0.85 5硫酸氨0.71 5蛋白胨0.73 5硝酸钠0.27 52.4 不同氮源浓度对菌种生长的影响氯化铵可以为光合细菌生长提供必要的氮源,图2为光密度值为0.10的紫色非硫细菌对不同质量分数的氯
10、化铵的利用情况.可以看出,氯化铵的最适添加量为0.2%0.3%,过量的氯化铵会抑制菌株的生长.2.5 酵母膏添加量对菌种生长的影响酵母膏中的营养丰富,含有微生物生长需要的各种生长因子.图3为不同质量分数的酵母膏对光密度值为0.15的紫色非硫细菌生长的影响.可以看出,酵母膏对紫色非硫细菌的生长有明显的刺激作用,当其背景质量分数为0.01%时可以明显促进菌体的生长,但质量分数过高同样会抑制菌体的生长.图3 酵母膏添加量对菌株生长的影响图4 复合无机盐溶液添加量对菌株生长的影响2.6 复合无机盐溶液添加量对菌种生长的影响复合无机盐对菌株的生长影响很大,添加少量复合无机盐可以促进菌株的生长速度,过量的
11、复合无机盐会抑制菌体的生长.图4为不同质量浓度复合无机盐对光密度值为0.10的紫色非硫细菌生长的影响.可以看出,复合无机盐的最佳添加量为0.2%.2.7 正交试验根据单因素试验的结果,设计了4因素3水平的正交分析表,接种的菌种光密度值为0.20,结果如表4所示.#6#安 徽 工 程 科 技 学 院 学 报2007年表4 正交试验结果分析因素处理号A(乙酸钠) B(氯化氨) C(酵母) D(复合无机盐) ODODE(OD)1 1(0.2%) 1(0.3%) 1(0.01%) 1(0.1%) 0.909 1.082 1.9912 1(0.2%) 2(0.4%) 2(0.03%) 2(0.2%) 1
12、.137 1.229 2.3663 1(0.2%) 3(0.5%) 3(0.05%) 3(0.3%) 1.31 1.222 2.5324 2(0.3%) 1(0.3%) 2(0.03%) 3(0.3%) 1.638 1.523 3.1615 2(0.3%) 2(0.4%) 3(0.05%) 1(0.1%) 1.553 1.638 3.1916 2(0.3%) 3(0.5%) 1(0.01%) 2(0.2%) 1.141 1.124 2.2657 3(0.4%) 1(0.3%) 3(0.05%) 2(0.2%) 1.309 1.286 2.5958 3(0.4%) 2(0.4%) 1(0.01%
13、) 3(0.3%) 0.409 0.44 0.8499 3(0.4%) 3(0.5%) 2(0.03%) 1(0.1%) 1.337 1.306 2.643K1 6.899 7.747 5.105 7.825K2 8.617 6.406 8.17 7.226K3 5.087 7.44 8.318 6.542K1 1.15 1.291 0.851 1.304K2 1.436 1.068 1.362 1.204K3 0.848 1.24 1.386 1.09R 0.588 0.223 0.535 0.214为了判断试验因素之间的差异是来自于随即误差还是来自于其本质的差异,对正交试验结果进行了方差分
14、析和多重比较,方差分析和多重比较的结果分别见表5和表6.表5 正交试验结果方差分析表误差来源自由度(df)平方和(SS)均方(MS) F P重复1 0.006 0.006 0.24 0.6359因素A 2 0.557 0.279 11.22* 0.0048因素B 2 0.165 0.082 3.31 0.0895因素C 2 1.097 0.548 22.08* 0.0006因素D 2 0.137 0.069 2.77 0.1222误差8 0.199 0.025总和17 2.160由表5可以看出,因素A和因素C的作用效果达到了极显著水平,从而说明乙酸钠和酵母的对光合细菌生长的影响均有重要影响.而
15、因素B和因素D均未达到显著水平,说明氯化铵和复合无机盐对光合细菌生长的影响差异不显著.表6 各因素水平间的多重比较(A=0.05)因素水平各组均数2 (0.3%) 1.436a乙酸钠(A) 1 (0.2%) 1.148 b3 (0.4%) 1.015 b1 (0.3%) 1.291 a氯化铵(B) 3 (0.5%) 1.240 b2 (0.4%) 1.068 ab3 (0.05%) 1.386 a酵母(C) 2 (0.03%) 1.362 a1 (0.01%) 0.850 b1 (0.1%) 1.304 a复合无机盐(D) 2 (0.2%) 1.204 a3 (0.3%) 1.090 a#7#第1期钱森和,等:紫色非硫光合细菌培养基条件优化的研究由表6可以看出,乙酸钠第二水平对光合细菌生长的影响最显著,第一水平和第三水平均与第二水平存在显著差异,第一水平与第三水平差异不显著;氯化铵第一水平对光合细菌生长的影响最显著,第一水平与第三水平存在显著差异,第一水平与第二水平以及第二水平与第三水平间差异不显著;酵母第三水平
