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1、实验四 凝胶过滤法分离蛋白质课程名称：生物化学与分子生物学实验课 年级：2005 专业、层次：临床医学本科 授课教师：符伟玉职称：讲师 学时：4学时基本教材：自编 生物化学与分子生物学实验指导教学目的与要求：1、熟悉凝胶过滤法分离蛋白质的基本原理。2、掌握凝胶过滤法分离蛋白质的实验操作。3、掌握凝胶过滤与PAGE中分子筛效应的区别。大体内容与时间安排：1、凝胶过滤法分离蛋白质的原理 10min2、凝胶过滤法的操作示范及注意事项 10min3、学生做实验 140min教学方法：讲授式+启发式教学重点、难点：重点：1、凝胶过滤法分离蛋白质的原理2、凝胶过滤与PAGE中分子筛效应的区别3、实验操作中
2、的装柱难点：1、凝胶过滤与PAGE中分子筛效应的区别 2、实验操作中的装柱一、实验原理凝胶过滤又叫分子筛层析。层析柱内填满带有小孔的颗粒，一般由葡聚糖制成。蛋白质溶液加于柱之顶部，待其与柱充分接触后随洗脱液往下渗，小分子蛋白质进入小孔内，因而在柱内停留的时间长，大分子蛋白质不能进入小孔径直流出，因此不同大小的蛋白质得以分离。本实验高铁血红蛋白分子量大，不易渗入颗粒小孔，被排阻在凝胶颗粒之外，先流出层析柱。高铁氰化钾【K3Fe(CN)6】分子量小，渗透到颗粒小孔的内部，洗脱时间长，后流出。这样就可以达到分级分离的目的。在血红蛋白(Mw64 500)中加入过量的高铁氰化钾(K3Fe(CN)6，Mw
3、327.25)，血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白(methemoglobin，MetHb)。为了除去多余的高铁氰化钾，得到较纯的MetHb样品，将上述混合物通过交联葡聚糖凝胶柱，用磷酸缓冲液洗脱，从颜色的不同，可直接观察到MetHb(红褐色)洗脱较快，而小分子高铁氰化钾(黄色)洗脱较慢，达到将MetHb完全分离出来的目的。二、操作步骤1、凝胶准备 称取5g交联葡聚糖G-25，倾入锥形瓶中，加蒸馏水约60ml溶胀，搅动后静置。待凝胶沉积后，用倾注法除去浮于表面的细粒，重复3次。将溶胀后的凝胶用10倍体积的磷酸缓冲液浸泡过夜，以达平衡。2、装柱 取玻璃层析柱(25cm1.5cm)一支，垂直
4、装好。加入缓冲液，打开出口，将气泡赶出，关闭出口。然后从管顶向柱内加入缓冲液8cm左右高，将平衡后的交联葡聚糖G-25悬浮液边搅拌边加入柱内，再打开出口，使液体流出，继续不断地加入交联葡聚糖G-25悬浮液，柱内凝胶柱床沉积至高20cm左右时为止。床面上覆盖3ml缓冲液，关闭出口，在凝胶柱面上加盖一层圆形滤纸，使层析柱稳定510min后，接储液瓶，打开出口，用2倍于床体积的磷酸缓冲液洗脱平衡，最后关闭出口。3、样品处理（1）血红蛋白溶液的制备：取草酸盐抗凝全血3ml离心，吸去上层血浆，加入5倍体积的冷生理盐水，混匀后3 000r/min离心5min，弃去上清液，重复洗3次。最后一次吸去上清液后，
5、在红细胞层上面加等体积蒸馏水，振摇。再加1/2体积CCl4，用力振摇3min，3 000r/min离心5min。吸取上层澄清的血红蛋白液备用。此溶液中Hb浓度约为10%(置4暂存，一周用完)。（2）样品：血红蛋白液3滴加K3Fe(CN)6 8滴和蒸馏水2滴混合，制成MetHb混合样品。4、上样、洗脱：打开平衡好的层析柱出口，使柱内溶液流出至刚露出柱床面时即关闭出口。吸混合物样品0.5ml左右，在距离床面1mm处沿管内壁轻轻转动加进样品，切勿搅动床面。然后打开出口，使样品进入床内，直至床面重新露出。同上加入12倍样品量体积的洗脱液(这样可以使样品定容至最小，而样品又完全进入床内)，当少量洗脱液将
6、流入床面时，加入多量的洗脱液，但注意切勿搅动床面凝胶，连接储液瓶进行洗脱。5、分部收集：用自动部分收集器，以5滴/min，10滴/管的速度进行收集。并且观察柱上的色带，待黄色的K3Fe(CN)6色带完全洗脱下来后，再继续收集两管透明的洗脱液作为空白，关闭出口。6、测定：将每管收集液加入蒸馏水至4ml，混匀，在425nm处测其吸光度，以吸光度为纵坐标，管编号为横坐标，绘出洗脱图谱。三、注意事项1、 装柱后要检查柱床是否均匀，若有气泡或分层的界面时，需要重新装柱。2、 上样时一定要靠近凝胶柱表面、沿柱内壁缓缓滴加，不能冲击凝胶柱表面。样品上柱后应在凝胶柱表面形成一层薄液层。3、 收集要及时，不能等红褐色物质流出之后再收集。4、流速不可太快。 5、尽量保持各管收集的液量一致。6、洗脱过程中要防止凝胶柱洗脱液流干。7、洗脱完成后凝胶要回收，勿丢弃。小 结凝胶过滤（又名：分子筛层析）是分离蛋白质、酶、核酸等生物大分子的常用手段。葡聚糖凝胶（商品名：Sephadex）是最常用的一种具有分子筛作用的物质。凝胶过滤主要用于分子量有明显差异的不同物质的分离。不同型号（交联度、孔径不同）的Sephadex应用于不同分子量范围。本实验应用Sephadex G-25分离高铁血红蛋白(methemoglobin，MetHb)和高铁氰化钾，得到较纯的MetHb样品。4
