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1、实验八：微生物大小及数量测定一、 实验目的1、学习并掌握使用显微测微尺测定微生物大小的方法；2、掌握对不同形态细菌大小测定的分类学基本要求，增强对微生物细胞大小的感性认识；3、学习并掌握使用血细胞计数板测定微生物细胞或孢子数量的方法。二、实验原理1、 微生物大小的测定微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小测定需借助测微尺-目镜测微尺和镜台测微尺，两者配合使用。镜台测微尺是一个在特制载玻片中央封固的标准刻尺，其尺度总长为1mm，精确分为10个大格，每个大格又分为10个小格，共100个小格，每个小格10m。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测
2、微尺每格地相对长度。目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，一般有等分为50小格和100小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物像。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格在不同条件下所代表的实际长度也不一样。因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞实际大小。2、显微直接计数法将小量待测样品悬浮液置于计菌器上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的
3、方法。显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如酵母、细菌、霉菌孢子等。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板或Hawksley计数板。三种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间较宽的平台，被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。计数区的刻度有两种：一种是计数区（大方格）分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格
4、，而每个中方格又分成16个小方格。计数区由400个小方格组成。每个大方格边长为1mm，其面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖载玻片间的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3。使用血球计数板计数时，通常测定五个中方格的微生物数量，求其平均值，再乘以25或16，就得到一个大方格的总菌数，然后再换算成1毫升菌液中微生物的数量。设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数B，则：1mL菌液中的总菌数= 25104B=5104AB （25个中格） = 16104B=3.2104AB（16个中格）三、 溶液试剂1、 菌种：酿酒酵母、枯草芽孢杆菌；2、 溶液试剂：0.1%吕氏碱性美蓝染液，蒸馏水；3、
5、 仪器及其他用品：目镜测微尺、镜台测微尺、普通光学显微镜、擦镜纸、血细胞计数板、移液器、锥形瓶、双层瓶（含二甲苯、香柏油）等。四、 实验内容1、微生物大小的测定（1）目镜测微尺的安装把一侧目镜的上透镜旋开，将目镜测微尺轻轻放在目镜的隔板上，使有刻度的一面朝下。旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。（2）校正目镜测微尺将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上。先用低倍镜观察，调焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行，利用推进器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的格数。用同样的方法
6、换成高倍镜和油镜进行校正，分别测出在高倍镜和油镜下两重合线之间两尺分别所占的格数。 由于已知镜台测微尺每格长10m，根据下列公式即可分别计算出在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度。目镜测微尺每格长度（m）= （3）菌体大小的测定 制作枯草芽孢杆菌的单染色制片洗片干燥加热、固定、干燥美蓝染色1min30s自然干燥 制作酵母水浸片玻片中央滴一滴美蓝接种酵母菌盖盖玻片 将镜台测微尺取下，换上细菌制片，先在低倍镜和高倍镜下找到目的物，然后在油镜下用目镜测微尺测量菌体的大小。先量出菌体的长和宽占目镜测微尺的格数，再以目镜测微尺每格的长度计算出菌体的长和宽。同一种群中的不同菌体细胞之间也存在个体差
7、异，因此在测定每一种菌种细胞大小时应对多个细胞进行测量，然后计算取平均值。本次实验取三个。2、显微镜计数（1） 血球计数板清洗。（2） 自然干燥。（3） 对酵母菌液进行适当的梯度稀释。取原液1mL到试管中，用移液管移取9mL水注入试管中。再取上一次稀释的菌液中的1mL加到另一支试管中，加9mL水。依此类推。即可得到一系列稀释梯度的菌液。（4） 加样品。血球计数板盖上盖玻片，将酵母菌悬液摇匀，用无菌滴管吸取少许，从计数板平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一滴，利用表面张力沟槽中流出多余的菌悬液。加样后静置5min，使细胞或孢子自然沉降。（5） 将加有样品的血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍
8、镜找到计数室所 在位置，然后换成高倍镜进行计数。若发现菌液太浓，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内有不多于5个菌体。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的一个中格）中的菌体进行计数。若有菌体位于格线上，则计数原则为计上不计下，计左不计右。如遇酵母出芽，芽体全记或全不计。（6） 清洗。使用完毕后，将血球计数板及盖玻片进行清洗、干燥，放回盒中，以备下次使用。五、 注意事项1、 使用镜台测微尺进行校正时，若一时无法直接找到测微尺，可先对刻尺外 的圆圈线进行准焦后再通过移动标本推进器进行寻找。2、细菌的个体微小，在进行细胞大小测定时一般应选用油镜，以减小误差。3、进行显微镜计数时应
9、先在低倍镜下寻找大方格的位置，找到计数室后将其移至视野中央，再换高倍镜观察和计数。4、酵母菌计数加样品前，一定将菌液摇匀。5、为了确定稀释梯度，可以先将酵母菌的原液加到计数板上计数。六、实验结果1、目镜测微尺校正结果物镜 物镜倍数 目镜测微尺格数 镜台测微尺格数 目镜测微尺代表的长度/m低倍镜 10 55 55 10 高倍镜 40 33 8 2.424油镜 100 21 2 0.9522、微生物大小测定结果表1 枯草芽孢杆菌大小测定记录（单位:油镜下目镜测微尺格数） 1 2 3 平均 长 度 3.0 2 2.5 2.5 宽 度 0.5 0.5 0.5 0.5 表2 酿酒酵母大小测定记录（单位:
10、40倍目镜测微尺格数） 1 2 3 平均 直径 5.0 5.0 6.0 5.3 表3 各菌测定结果名称目镜测微尺每格代表的长度（m）长宽菌体大小/长宽（mm）目镜测微尺平均格数长度/m目镜测微尺平均格数宽度/m枯草芽孢杆菌0.9522.52.380.50.4762.380.476酿酒酵母0.9525.35.046-5.0462、 酵母菌显微计数结果（A表示5个中格中总菌数，B表示菌液稀释倍数） 酵母菌数量的测定结果菌种AB菌数/mL酵母菌202100.99108七、思考题和小结1 为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？答：因为在不同放大倍数的目镜或物镜下，目镜测微尺每格代表的长度会发生变化。2 在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？答：相同。因为用不同的物镜时都重新校正目镜测微尺，目镜测微尺每格代表的长度可按照重新校正的数据计算。3 哪些因素会造成血球计数板的计数误差，应如何避免？答：器材处理、使用不当，稀释不准确，细胞识别错误等因素所造成的误差；由于仪器（计数板、盖片、吸管等）不够准确与精密带来的误差；由于细胞分布不均匀等因素带来的细胞计数误差。前两者可通过规范操作、提高熟练程度和校正仪器而避免或纠正；细胞分布误差可通过多次计数取平均值来减小。5
