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1、IgA肾病小鼠模型的建立与鉴定【摘要】目的建立小鼠IgA肾病模型，为临床研究IgA肾病提供实验根据。方法昆明种小鼠30只，分为正常对照组(10只)、模型组(20只)。采用口服牛血清白蛋白(BSA)结合尾静脉注射葡萄球菌肠毒素B(SEB)的方法制作小鼠IgA肾病模型。第12周末搜集新颖尿液，显微镜下尿红细胞定性检验;摘眼球取血，检测血肌酐(Sr)、尿素氮(BUN);光镜法观察肾小球系膜细胞及基质变化;电镜法检测系膜区有无电子致密物沉积;免疫荧光法观察系膜区IgA沉积情况。结果第12周末，模型组小鼠均出现不同程度的血尿;Sr、BUN较正常对照组显著增高(P0.01);光镜下系膜细胞及基质明显增生;
2、电镜下系膜区电子致密物沉积;免疫荧光示系膜区大量的IgA沉积，而正常对照组那么无上述表现。结论IgA肾病小鼠模型效果良好，病理、电镜及临床指标与人类IgA肾病临床病理相似。【关键词】IgA肾病;模型;血尿;免疫荧光;小鼠Abstrat:bjetiveTestablishusedelfIgAnephrpathyinrdertprvideexperientbasisfrthelinialresearhfIgAnephrpathy.ethds30Kuningieererandlyassignedintthentrlgrup(n=10)andthedelgrup(n=20).usedelfIgAnep
3、hrpathyasestablishedbytheethdfralintakefbvineserualbuin(BSA)tgetherithinjetinfstaphylusentertxinB(SEB)viatheaudalvEin.Attheendfthe12eeks,freshurineasgatheredfrthequantitativetestfheaturia;bldastakenthrughrbitalsinusaftereyeballextirpatintdeterinetheserureatinine(Sr)andbldureanitrgen(BUN);thehangesfe
4、sangialellsandatrixinthekidneyserebservedbylightirspy;eletrnirspyaseplyedtdeteteletrn-densedepsitsintheesangialarea;theexpressinfIgAdepsitinaseasuredbyiunfluresenestainingintheesangialarea.ResultsBytheendf12eeks,thereeredifferentdegreesfheaturiaindelgrupie.BUNandSrlevelsindelgruperesignifiantlyhighe
5、rthaninthenralntrlgrup(P0.01).Lightirspyshedevidentprliferatinfesangialellsandatrix.Eletrnirspydenstratedahigheletrndensedepsitinintheesangialarea,hiletheabveabnralitieserentbservedinthenralntrlgrup.nlusinTheusedelfIgAnephrpathyprveseffetive,ithpathlgialeletrnirspiandlinialparaeterssiilartthelinialp
6、athlgyfhuanIgAnephrpathy.Keyrds:IgAnephrpathy;del;heaturia;iunfluresenestaining;ieIgA肾病世界范围内广发的一种系膜增生型肾小球肾炎，占原发性肾小球疾病的10%20%，中国、日本、新加坡等发病率较高，其中有20%30%的患者进展到肾衰1。建立与人类临床病理生理相似的IgA肾病动物模型，对研究IgA肾病的发病机理、临床治疗等具有重要的作用。本实验采用口服牛血清白蛋白结合尾静脉注射葡萄球菌肠毒素的方法制作IgA肾病小鼠模型，为进一步探究IgA肾病提供实验根据。1材料和方法1.1实验材料1.1.2主要实验试剂和设备牛血
7、清白蛋白(BSA,上海明睿生物，产品批号RF101-010);葡萄球菌肠毒素B(SEB,北京博迈世纪生物技术);兔抗小鼠IgA抗体(北京博奥森生物技术，抗体货号bs-0774R);异硫氰酸荧光素(FIT)-标记的羊抗兔IgG(illiprerpratin);irH340石蜡切片机;光学显微镜(日本artn);日本SysexA-1500自动生化分析仪;电镜(H-600)，切片机(LKBV型)。1.2实验方法1.2.1酸化水的制备新颖的双蒸水中参加盐酸，浓度为8.5l/L。即1000l双蒸水中参加10%盐酸3.2l。1%BSA酸化水的制备,1gBSA参加100l酸化水。1.2.2造模方法适应性喂养
8、1周后，取新颖尿液进展显微镜下尿红细胞检测，均为阴性，将30只小鼠随机分为正常对照组(10只)、模型组(20只)。正常对照组小鼠自由饮水与饮食;模型组小鼠除自由饮水和饮食外，前5周隔日予BSA(200g/kg)灌胃;第6周起予BSA(20g/kg，500gBSA溶于500l无菌生理盐水中)尾静脉注射，每天1次，连续3天;第8周起予SEB(0.5g/kg,1gSEB溶于25l无菌生理盐水中)尾静脉注射，每周1次，连续3周，观察至第12周末。1.2.3IgA肾病小鼠模型的鉴定1.2.3.1血、尿液检测第12周末留取小鼠新颖尿液，行尿红细胞定性检测;经摘眼球取血(待测Sr，BUN)后，处死小鼠，留取
9、右侧肾脏分别固定于10%甲醛及戊二醛中，行病理(光镜和电镜)及免疫荧光检查。1.2.3.3电镜检查取材,前固定,漂洗,后固定,漂洗,脱水，置换及浸透，包埋及聚合，修块及切片，染色，电镜观察。1.2.3.4免疫荧光小鼠肾组织经10%甲醛固定，石蜡包埋，5切片依次经二甲苯20in,二甲苯20in,95%乙醇5in,95%乙醇5in,双蒸水5in3次,3%H2210in,PBS5in3次,抗原修复(微波炉中高火5in,低火15in),自然冷却,PBS5in3次,5%羊血清1h,兔抗小鼠IgA(1100),4过夜,PBS5in3,FIT标记羊抗兔IgG(1100)4过夜,PBS5in3,甘油封片,荧光
10、显微镜下观察摄像。免疫荧光半定量标准:半定量标准参照目前国内通用的5级法(+)分级:：低倍镜下不能显示;+：低倍镜下似乎可见，高倍镜下可见;+:低倍镜下可见，高倍镜下明晰可见;+：低倍镜下明晰可见，高倍镜下耀眼;+:高倍镜下刺眼。1.3统计学处理全部数据采用SPSS13.0医学统计软件进展处理，计数资料用s差表示，采用两独立样本t检验;等级资料用两独立样本非参数检验。P0.01为差异有统计学意义。转贴于论文联盟.ll.2结果2.1一般情况造模过程中，正常对照组小鼠无死亡，模型组小鼠先后死亡3只，分析原因可能是灌胃器误插入气管，或插入过深导致小鼠食管及胃黏膜损伤。尾静脉注射SEB后，小鼠出现倦耽
11、少吃少动等现象，2h后恢复正常。2.2血、尿指标检测12周末，采集新颖尿液光镜下尿红细胞计数。结果显示模型组小鼠明显高于正常对照组(P0.01)(表1);摘眼球取血，留取血清，检测血Sr和BUN。结果显示模型组较正常对照组明显升高(P0.01)(表2)。表12组小鼠尿红细胞计数的比拟表22组血BUN和Sr的比与正常对照组比拟：*P0.012.3镜下构造改变2.3.1光镜模型组小鼠肾组织主要表现为肾小球毛细血管襻扩张，系膜细胞及基质明显增生，毛细血管腔局部闭锁，局部小管扩张;光镜下正常对照组小鼠肾小球，肾小管，及间质组织形态构造未见异常，系膜细胞及细胞基质未见增多(图1)。图112周末，各组小鼠
12、光镜下肾组织病理变化的比拟(H-E染色，400)A.模型组,肾小球系膜细胞及基质增生,毛细血管腔局部闭锁，局部小管扩张;B.正常对照组,肾小球系膜细胞及基质未见增生,毛细血管开放良好2.3.2电镜模型组小鼠肾小球系膜区有大量电子致密物沉积，而正常组小鼠肾小球系膜区无或有少量的电子致密物沉积(图2)。图212周末，各组小鼠电镜下肾组织病理变化的比拟(10000)A.模型组,系膜区大量的电子致密物沉积;B.正常对照组,系膜区无电子致密物沉积2.4免疫荧光检测12周末，免疫荧光可以看到，系膜区IgA荧光强度大多为+，而正常组系膜区IgA荧光强度为+，差异有统计学意义(表3、图3)。表32组小鼠肾脏系
13、膜区IgA荧光半定量比拟3讨论自Rifai等于1979年首次用BALB/小鼠成功制作IgA肾病模型以来，许多学者基于IgA肾病的发病机制成功复制了许多IgA肾病模型2-6。主要包括:免疫诱导型、继发病变型、自发病变型。但由于存在种种问题，与人的IgA肾病病理变化差距很大，模型建立的滞后导致对IgA肾病的研究较少，对IgA肾病的治疗未获得新的手段。国内常用的IgA肾病为异种蛋白所诱导的免疫诱导型，即口服牛血清白蛋白(BSA)结合尾静脉注射葡萄球菌肠毒素(SEB)。由于局部患者对某些上呼吸道病原体、肠道菌群、食物抗原有较高的血清抗体滴度，认为黏膜免疫在发病中起到一定作用7。故口服免疫原如BSA及静
14、脉注射葡萄球菌、大肠杆菌、呼吸道病毒等病原微生物成分或免疫复合物常用于诱导主动性IgA肾病模型。BSA口服免疫可使机体IgA抗体的产生，SEB的详细机制目前还不十清楚确，大多数认为SEB还可破环肝脏网状内皮系统，引起IgA去除不完全，进而引起免疫复合物在系膜区的沉积。17只模型小鼠荧光证实全部有IgA沉积;光镜下肾小球系膜细胞和系膜基质增生;电镜下肾小球系膜区可见大量的高电子密度的致密物沉积;临床的尿、血检测随着肾脏病理变化的加重而逐渐加重，且与正常组比拟差异有统计学意义，说明造模成功。此方法操作简单，重复性好，成功率高，应该是目前理想的、有研究价值的动物模型，能为进一步研究IgA肾病的发病机
15、制及治疗提供根底平台。【参考文献】1DnadiJV，GrandeJP.IgAnephrpathyJ.NEnglJed，2002，347(10)：738-748.2BagheriN,PeppleDA，Hassan,etal.DevelpentfiuneplexglerularinjuryJ.LabInvest,2022,85(3):354-363.3JiaQ,PestkaJJ.Rlefylxygenase-2indexynivalenl-induediunglbulinanephrpathyJ.FdheTxil,2022,43(5):721-728.4KyaaA,SharinS,SakuraiH
16、,etal.StaphylusaureusellenvelpeantigenisaneandidatefrtheindutinfIgAnephrpathyJ.KidneyInt,2022,66(1):121-132.5SuzukiS,GejyF,NakatiY,etal.RlefIgA,IgG,andIgantibdiesagainstHaephilusparainfluenzaeantigensinIgAnephrpathyJ.linNephrl,1996,46(5)：287-295.6SharinS,ShiizuY,Hagiara,etal.Staphylusaureusantigensindue
