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1、维生素的测定概述维生素是调节人体各种新陈代谢过程必不可少的重要营养素。人体如从膳食中摄入维生素的量不足或者机体由于某种原因吸收或合成发生障碍时，就会引起各种维生素缺乏症。近几年已经查明仅有少数几种维生素可以在体内合成，大多数维生素都必须由食物供给。因此，维生素作为强化剂已在食品工业的某些产品中开始使用，测定食品中的维生素含量，不仅可评价食品的营养价值，同时还起到监督维生素强化食品的剂量，以防摄入过多的维生素而引起中毒，所以，测定食品中维生素在营养分析方面具有重要的意义。维生素的种类繁多，而且这些有机物的结构也很复杂，有的属于胺类（为B1），有的属于醛类（为B6），有的属于醇类（为A），有一些属
2、于酚或醌类化合物等。目前已发现的维生素约有二、三十种，按维生素溶解性能可将它们分成两大类：一类是能溶在脂肪中的，叫脂溶性微生物素（如A、D、E、K等）；另一类是能溶解在水中的，叫水溶性维生素（如B1、B2、B6、C、B12等）。在这二类中与我们最密切，而且了解最多的有：维生素A：是人体必需营养素，能促进人体发育，防止眼膜炎、夜盲症等疾病。维生素B：也叫硫胺素，对人体的功能主要是防脚气病、神经炎，帮助消化，促进发育。维生素B2：对人体功能防口角炎、皮肤炎，防止怕光现象。维生素C：防坏血病，促进外伤愈合，使机体增强抵抗力。维生素D：调节体内矿物盐的平衡，特别是对人体内钙、磷的代谢，并能防止软骨病。
3、水溶性维生素的测定一、维生素B1的测定VB1又叫硫胺素1、食品中VB1的存在形式 常以游离态存在；复合脂形式存在（磷蛋白）； 辅羧酶形式存在VB1在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色的蔬菜和牛乳、蛋黄中比较丰富，动物组织不如植物含量丰富。2、VB1的性质 VB1在中性、碱性下不稳定，易分解； VB1在酸性条件下稳定，即使加热酸性也稳定； VB1为白色结晶，微溶于C2H5OH，不溶于乙醚或CHCl3，易溶于水。3、VB1的测定世界各国都用荧光法测定 原理：硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中，被氧化成一种兰色荧光物质，即为硫色素，在紫外光下，硫色素发出荧光。 方法 萃取100g样品于干燥烧杯中，加入10
4、0ml0.1N H2SO4，打成匀浆，煮沸30分钟，称取一定的样品经高压锅121、20分钟高压酸解 水解在酸解的样品中冷却后加入含有10%糖化酶的10ml2.5MNaAC溶液，摇匀，用15%NaOH调PH=4.5，用淀粉酶使淀粉水解，也可用磷酸酶使淀粉水解，于50恒温箱中12小时 纯化采用柱层析提纯吸附剂采用的是人造浮石。人造浮石用25%KCl溶液分数次洗涤，主要是把VB1吸附上去，吸附上去后，再用热水淋洗，最后用25%KCl-HAC把VB1洗脱下来，这样就得到纯VB1，再根据上面的原理在碱性下分析。 分析装填柱子（离子交换柱） 提纯 氧化 测定脂溶性维生素的测定一、维生素A目前维生素A都是合
5、成的，来源：（1）从动物肝脏中得到；（2）从维生素前体而得到（维生素前体：主要指类胡萝卜素，主要是-胡萝卜素）维生素A的测定常用的方法有三氯化锑比色法、紫外分光光度法、荧光分析法、液相色谱法。对于三氯化锑比色法适用于样品中含VA高的样品，方法简便、快速、结果准确，但是对维生素A含量低的样品，如每克样品中含510g维生素A时，这时样品由于受其脂溶性物质的干扰，不应用比色法测定。对于紫外分光光度法不必加显色剂显色，可直接测定维生素A的含量，对样品中含VA低的也可以测出可信结果，操作简便、快速。1、维生素A的性质 因有许多不饱和链，故见光易分解； 在缺氧情况下，对热较稳定，对光特别敏感。如测强化奶粉
6、时，速度要快，一般要求测定时间长短，因为时间长，见光时间长，见光分解，故测出的比出厂的含量要少； 对碱稳定；2、测定步骤 样品用有机溶剂萃取脂类样品可以根据脂肪的测定处理脂肪，即索氏抽提法，采用乙醚作提取剂，也可用热苯回流方法提取脂类。如果样品中含蛋白质和淀粉多的情况下可采用乙醚提取法。脂类的皂化脂类有维生素和脂肪这两部分通过皂化（50%KOH、无水C2H3OH、热回流）把它们分开，得到一部分皂化物和一部分不皂化物。皂化条件：（1）C2H3OH脂类 = 81；（2）KOH量 = 脂量皂化价（mg）2.5；（3）皂化温度与时间：70、30分钟在皂化时可以加入抗氧剂连苯二酚和对苯二酚，防止氧化。
7、提取：不皂化物和皂化物经水、苯、乙醚萃取可得到不皂化物。 柱层析分离干扰物质采用柱层析分离干扰物质，如果柱层析把-胡萝卜素也洗脱下来，那么这时维生素A与-胡萝卜素就是一个混合物，还要将它们分离开。如果样品中只有维生素A而不含-胡萝卜素时，这时可直接定容。维生素A与-胡萝卜素分离：吸附剂： 8分中性Al2O3和2分碱性Al2O3混合，装柱分离方法：a. 用2%丙酮石油醚洗-胡萝卜素；b. 用乙醚洗VA。3、测定方法 SbCl3比色法维生素ACHCl3 SbCl3CHCl3形成兰色物质在620nm有最大吸光峰这种兰色物质不稳定，很快褪色或变成其它物质，所以在分析时最好在暗室中进行，并且做标准曲线。
8、计算：每百克样品含VA的量= C（V1/V2）（100/W）C ：从标准曲线上查得VA的量V1 ： CHCl3定容的量V2 ： 测定所取样液体积 紫外分光光度法a. 原理：VA为脂溶性的，测定VA时必须先将样品中的脂肪抽提出来进行皂化，萃取不皂化部分，在经柱层析除去杂质等干扰物质，在紫外328nm下测定，求出含量。b. 方法1） 提取及皂化称样10.00g 于烧杯中 加40ml水搅匀 移250ml分液漏斗中 加氨水5ml 加乙醇35ml 摇匀 用乙醚抽提（每次40ml抽提三次） 收集乙醚层 用10ml水洗乙醚层三次 水层再用30ml乙醚抽提一次 合并所用乙醚 用索氏法除乙醚 待瓶中乙醚除尽后
9、加30ml80%的KOH 40mlC2H5OH 加0.8g焦性没食子酸 83水浴30分钟（皂化脂肪） 冷却后移入250ml分液漏斗中 加60ml水 用40ml乙醚抽提三次 合并乙醚抽提液 用水洗至中性 用索氏法除乙醚 除去后用5ml石油醚溶解瓶中内容物 然后移入刻度试管中2）层析在层析柱内装8cm高度中性氧化铝 2cm高度碱性氧化铝及1cm无水硫酸钠 以石油醚浸透 装皂化后的样液慢慢于柱内 用12ml石油醚洗试管 洗液倒入柱内，活塞打开以每分钟为35滴左右的速度打开，当液面降到接近硫酸钠时 加5ml石油醚 随后用5ml洗脱液逐次洗涤。层析柱上第一个黄色层析层，一般是-胡萝卜素，此带在12%洗脱
10、液前后洗去，收集于10ml容量瓶中直到流出物不呈黄色为止，此层可测-胡萝卜素用，而VA一般在50%洗脱液洗出，用2ml刻度吸管收集1ml。吸约0.2ml于小试管中加0.3ml25%三氯化锑溶液如呈兰色表明有VA存在，故0.5ml用石油醚定容10ml。3）样液测定以石油醚为空白4）计算 VA(I.100G)=(E1062)/(1830100W)(1000/0.3) 0.3 ：每0.3g VA相当于1 I. E ： 消光值 W ： 样品重量（g）1830 ：石油醚中其消光值1%cm为1830（I.）： 一个国际单位，维生素A相当于0.6 g-胡萝卜素。4、试剂 50%KOH； 无水硫酸钠； 乙醚（
11、不含过氧化氢）； 石油醚； 苯； 45%C2H5OH（应不含醛类物质）酒精中含醛类的检查方法：首先配银氨溶液，在50%硝酸银溶液中加入浓氨水，直到氧化银沉淀又重新溶解为止，在小试管中加2ml银氨溶液，加35滴酒精，摇匀，加10%NaOH 1滴加热，若有银镜反应，表示乙醇中含有醛。脱醛处理：取乙醇2000ml 加AgNO32g 振摇溶解 加NaOH 4g 振摇溶解 过滤 上清液 蒸馏 即可 2025% SbCl3的CHCl3先量取100mlCHCl3于广口瓶中，用减差法称取一定量的干燥SbCl3，SbCl3易吸水，所以必需蒸馏重结晶后使用，一般用沙浴上加热。二、维生素D维生素D在鱼肝油和鸡蛋黄等
12、食品中含量较多，一般成人不会缺VD，而婴儿容易缺乏。1、操作步骤 提取 样品（奶粉）水混匀 在NH4OH的作用下酪蛋白Ca盐溶解加入乙醇使脂肪球分离乙醚、石油醚萃取得到脂质（其它样品可用索氏提取得到脂质） 皂化在奶粉中脂溶性物质有VD、-胡萝卜素、VA、VE、甾醇、脂肪。目前皂化有三种情况：低温（室温）中温（702）高温（10015min）低碱低碱低碱回收率不完全回收率46%回收率70%低碱 = 脂肪KOH为12.5的关系另外在皂化时加抗氧化剂与不加抗氧化剂回收率不一样，加抗氧化剂的回收率高于不加抗氧化剂的回收率。有人将上面的皂化条件互补，采用中温-高碱并加抗氧化剂，这样的回收率为96.8%，
13、效果较好。故皂化条件 ：702高碱 + 抗氧化剂 萃取 除甾醇甾醇在食品中含量较多，主要是通过柱子，这个柱子就是毛地黄皂甙。甾醇 + 毛地黄皂甙 沉淀洗脱液用乙醚己烷 = 15配制而成甾醇毛地黄皂甙 = 114 用量 皂土柱层析当VD与VA共存时，须用皂土柱层析除VA及VA的分解产物。测定方法有两种：比色法：维生素ACHCl3 SbCl3CHCl3乙酰氮 形成橙黄色物质 500 nm下测定紫外分光光度法VD乙醇 265 nm下测定维生素C的测定维生素C是一种已糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以被人们称做抗坏血酸，主要为还原型及脱氢型两种，广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦
14、瓜、柿子叶、猕猴桃、柑橘等食品中含量较多。它是氧化还原酶之一，本身易被氧化，但在有些条件下又是一种抗氧化剂。维生素C（还原型）纯品为白色无臭结晶，熔点190192，溶于水或乙醇中，不溶于油剂。在水溶液中易被氧化，在碱性条件下易分解，在弱酸条件中较稳定，维生素C开始氧化为脱氢型抗坏血酸（有生理作用）。如果进一步水解则生成2，3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。根据它具有的还原性质可以测定维生素C的含量。常用的测定方法有（1）2，6-二氯靛酚法 （还原型VC）（2）2，4-二硝基苯肼法 （总VC）（3）碘酸法（4）碘量法（5）荧光分光光度法一、2，6-二氯靛酚滴定法1、原理：还原型抗坏血酸还原染料2，6-二氯靛酚，该染料在酸性中呈红色，被还原后红色消失。还原型抗坏血酸还原2，6-二氯靛酚后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准2，6-二氯靛酚的量与样品中所含维生素C的量成正比。2、试剂 1%草酸溶液：称取10g草酸，加水至1000ml； 2%草酸溶液：称20g草酸，加水至1000ml； 维生素C标准液：准确称20mgVC溶于1%草酸中，并稀释至100ml，吸5ml于50ml容量瓶中，加入1%草酸至刻度，此溶液每毫升含有0.02mgVC； 0.02%2，6-二氯靛酚溶液：称取2，6-二氯靛酚50mg，溶于200ml含有52mg碳酸氢钠的热水中，冷却
