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1、1、细胞培养上清：即在4C下，首先300Xg离心10 min，吸取上清液，然后2 000Xg离心10 min；吸取上清液后，10 000Xg 高速离心30 min,吸取上清液；140000Xg超速离心90 min；除 去上清液，所获得的沉淀即为外泌体。用PBS缓冲液洗涤沉淀并 重悬后，140 000Xg再次离心90 min，100 uL PBS缓冲液重悬 沉淀，冻存于-80C备用。2、将小鼠或人血收集在1.5mL管中，并使其在37C下凝结1小时而不进行抗凝。此后，将其以2,000Xg离心持续10分钟获得 血清。接着将血清以3,000Xg离心10分钟。将上清液以无菌PBS 以1：1的比例稀释并离
2、心再次以10,000Xg保持30分钟，然后 以200,000Xg进行2小时超速离心。将颗粒在a中洗涤大量PBS， 通过0.2-um注射器过滤器过滤，并以200,000Xg离心1小时， 然后收集沉淀并重悬于PBS或PBS中用于后期功能或生化测定的培养基。3、 为了从体液（例如尿液，支气管肺泡灌洗液，血清，血浆，肿瘤腹水） 中纯化外泌体，只需通过常规方法收集液体即可。血浆用紫色的管子，Iuh Ji _91 |1 F r1 I ! 3 r1 1 La * W I n 1- I % I I|T q1 *- yf 迓hI ff H 1 J 孝EDTA抗凝，血清的话不抗凝直接离心。在4C下在玻璃瓶中储存长
3、 达5天，直至进行外泌体纯化。外泌体纯化的原理与从组织培养条件培养基开始时的原理相同，但由 于某些流体的粘度，必须稀释它们，并增加离心的速度和长度。该方 案已在作者的实验室中用于从人血浆中纯化外泌体（Caby等，2005）。 基本方案1中指出的所有预处理也适用于该方案。材料液体（例如， 血浆：通过Ficoll离心与血细胞分离;淋巴，血清，尿液，细支气管 灌洗或肿瘤腹水）磷酸盐缓冲盐水（PBS;附录）2A）冷冻离心机 50毫升聚丙烯离心管0.22微米过滤装置（如Steritop，Millipore） 超速离心机和固定角度或摆动式转子（见表3.22.1）适用于超速离心 机转子的聚合物管或聚碳酸酯瓶
4、（见表3.22）0.1） 注意：所有离心均应在4C下进行。1. 用等体积的PBS稀释液体。将稀释的液体转移到50毫升管中。在 2,000Xg，4C下离心30分钟。2. 将上清液转移到超速离心管或瓶中，没有颗粒污染（参见基本方案 1，步骤3注释）。在12,000Xg，4C下离心45分钟。3. 小心地将上清液转移到超速离心管或瓶中（根据处理的液体体积， 可参见表3.22.1中的管）。在110,000Xg，4C下离心2小时。4. 将沉淀重悬于1ml PBS中，并将其在其中一个管中汇集。用PBS填 充管以大量稀释再悬浮液。5. 通过0.22- um过滤器过滤悬浮液，并收集在新鲜的超速离心管或 瓶中。6. 在110,000Xg，4C下离心70分钟。倒出上清液。7. 将沉淀重悬于1ml PBS中，然后用PBS填充管。在110,000Xg， 4C下离心70分钟。倒出上清液。8. 将沉淀重悬于50至200 ulPBS中。在-80C下储存长达1年。
