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1、实验设计:柚子溃疡病病原菌的分离鉴定、致病性测定及菌种保存一、实验目的了解并掌握细菌性病害病原菌的分离培养鉴定及致病性测定的方法，并对分离纯化的菌种进 行保存。二、实验材料供试材料：患有溃疡病且病斑明显的新鲜柚子叶片；健康的新鲜柚子叶片实验用品：75%酒精、升汞（或次氯酸钠）、无菌水、PDA培养基手术剪、镊子、培养皿、酒精灯等三、试验方法与步骤1、病原菌的分离与纯培养 分离材料的选择：取新鲜发病的叶片病组织用自来水冲洗干净，剪取病健交界处组织, 剪成5X5mm左右的小块置于小烧杯中； 分离材料的消毒：加入适量75 %的酒精,30秒后倒出，再加适量升汞，2分钟后倒出， 用无菌水冲洗2 3次； 接
2、种：在酒精灯前进行操作，将处理好的叶片接种至含PDA培养基的培养皿内，标记，封 口，置于27 C恒温箱中培养； 纯培养:长出明显可见的菌落后，再挑取少许菌脓用划线法接种在PDA培养基平板作纯化 培养，多次重复操作直至长出单菌落。2、病原菌的鉴定取培养18小时的细菌单菌落，涂于载玻片上进行负染，电镜下观察菌体的形态、大小、鞭毛 特征；菌体菌落形态主要观察单菌落形状、大小、颜色、表面、边缘、隆起特征、透明度等。3、病原菌致病性测定 菌悬液制备：挑取纯化的细菌单菌落，用无菌水配成菌悬液； 接种：选取10片健康的新鲜柚子叶片，用灭过菌的接种针刺小孔，其中7片用菌悬液均匀 喷洒在叶片上，另外3片喷无菌水作为对照； 接种完毕后，套上保鲜膜保湿，7天后观察记录发病情况。4、菌种保存斜面传代培养保存：将细菌接种于琼脂斜面培养基上（如普通琼脂斜面、血液琼脂斜面、 鸡蛋琼脂斜面等），置温箱18-24h培养后，将棉塞换成橡胶塞用灭菌固体石蜡熔封，移至TC 冰箱保存，一般细菌在4 C冰箱内可以保存一个月。半固体培养保存：用穿刺接种法将细菌接种于半固体培养基内，置温箱培养18-24h后， 在表面加上一层无菌液体石蜡，约1厘米，治愈4 C冰箱保存。一般细菌可保存3个月至半年。 传代时应先将试管倾斜，使液体石蜡留置一边，再用接种针取细菌细菌菌种接种于新培养基 上。
