代谢物批量定量工具的开发与应用

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1、代谢物批量定量工具的开发与应用卫润民1，黄凤杰1,2，谢 燮1，池逸2，郑晓皎2， 赵爱华2，陈天璐2 【摘要】摘要 目的 针对代谢组学研究中的定量分析需求，开发一款可以自动 绘制标准曲线和定量计算的软件工具，并采用该工具对一批临床血清样本进行 定量计算。方法 使用代谢物批量定量工具对临床血清样本的代谢组学检测结果 进行定量计算，包括建立标准曲线、自动拟合和手动拟合及样本中代谢物的定 量。结果 建立 40 个代谢物的标准曲线，对 90 例临床血清样本进行定量计算， 获得绝对浓度。结论 代谢物批量定量工具可以对代谢组学研究中批量样本的大 量代谢产物进行快速定量计算。软件具备数据变换和缺失值补充等

2、基本数据预 处理功能。该软件的应用有助于提升代谢组学物质定量环节的自动化和标准化 程度，有效降低人为因素导致的误差，提高数据分析的效率和准确性。期刊名称】上海交通大学学报(医学版)年(卷),期】2015(035)001总页数】5关键词】关键词 代谢组学;定量;自动化 技术与方法 代谢组学(metabonomics/metabolomics)是20世纪90年代末发展起来的一 门新兴学科。主要研究内容为定性/定量地描述生命体对外界刺激、病理生理变 化及本身基因突变而产生的体内代谢物水平和代谢系统的动态变化规律。随着 靶向代谢组学(targeted metabolomics)的发展，代谢物的定性或半

3、定量结果 已不能满足研究和应用的需求，对代谢物进行绝对定量已成为代谢组学研究的 发展趋势1。 Lee 等2在采用代谢组学方法研究壬基苯酚毒性作用时，同时进行了定性的代 谢指纹谱分析和针对雌激素、雄激素、肾上腺皮质激素的靶向定量研究，结果 发现通过代谢指纹图谱的变化规律可以揭示毒性作用与剂量的相关性；而在定 量的靶向分析中，毒性作用进一步呈现出与时间的相关性。Wang等3在神经 管畸形的研究中也强调了定量的重要性，对同一批样本进行了代谢指纹谱分析， 并同时对一碳代谢循环通路上关键的 11 个代谢物进行了定量测定，使研究结 果更具备说服力。可见，定量的代谢组学研究有助于促进人们对疾病机制的理 解，

4、以及对预防、治疗中相关生物标志物的发掘，从而使代谢组学技术在疾病 预防和相关领域中的应用更加有效4。 代谢组学研究的仪器平台基本可分为核磁共振 (nuclear magnetic resonance,NMR)和质谱联用两种。核磁平台的显著优势是重复性好、测量时间短、样本 处理相对简单且可以回收利用；但其灵敏度与质谱检测器相比较低 5，且由于 生物体液 NMR 图谱中含有大量信息，对图谱中的所有峰进行完全归属非常困 难。质谱联用平台主要包括气相色谱质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)、液相色谱质谱联用(liquid chromatog

5、raphy-mass spectrometry, LC-MS)和毛细管电泳质谱联用(capillary electrophoresismass spectrometry,CE-MS)。其中，GC-MS技术已趋于成熟，适用于对易挥 发、半挥发性有机小分子化合物进行分析。LC-MS技术处于迅速发展阶段，适 用于对亲水性及挥发性强的有机物或热不稳定的化合物及生物大分子进行分析 7。CE-MS综合了 CE的高效分离能力、广泛的样本适应性和MS的高灵敏度、 可提供结构信息等优势，已发展成为一种重要的分离分析手段；但其在迁移时 间的重现性、进样准确性和检测灵敏度方面依然存在不足8。 不同公司针对不同仪器平

6、台开发了各种商业软件可以对其产生的数据进行处理 和分析： Waters 公司的 MarkerLynx 和 TargetLynx,Agilent 公 司的 MassHunter,Leco公司的 ChromaTof及 Spectral Works 公司的 Analyzer 等。 这些商业软件一般是为某一种仪器平台服务的，不仅价格昂贵而且对用户的限 制较多。Waters公司的TargetLynx可以对UPLC-TQMS数据进行定量，但在 建立标准曲线时无法对数据进行外标校正，不提供去噪和分布调整等基本的数 据调理功能，标准曲线的结果无法以数字形式导出，可导出的定量结果有格式 的限制而无法直接用于多维

7、统计分析；Leco公司的ChromaTof和Agilent公 司的 MassHunter 软件也包含定量功能但都存在操作复杂和导出结果无法直接 导入其他软件等问题；因此，在峰强度信息基础上进行人工操作仍是代谢物定 量的主要方式。除了商用软件，许多研究者开发了一系列开源或免费的软件工具用于处理和分 析不同仪器平台产生的数据。应用于 NMR 仪器平台的 MetaboLab9、 NMRLab10和 rNMR11等；应用于 GC-MS 仪器平台的 AMDIS12、 MetAlign13 、 MathDAMP14 、 MetaQuant15 、 TagFinder16 、 MSFACTs17、Metab

8、18(Aggio,R.)、ADAP-GC19和 MZmine20等。应 用于 LC-MS 仪器平台的 XCMS21、MetAlign13、MathDAMP14和 MZmine20 ； 应 用 于 CE-MS 仪 器 平 台的 MathDAMP14 。 其 中 MetAlgin13和 MZmine20可以支持 GC-MS和LC-MS两种平台，而 MathDAMP14可以应用于所有质谱联用平台，即GC-MS、LC-MS、CE-MS。 以上能实现定量的软件仅有 ADAP-GC19、MetaQuant15、TagFinder16 rNMR11，而这4款软件都只适用于特定仪器平台产生的数据，应用范围有限

9、。通过文献检索，尚未发现可以独立于不同仪器平台对代谢产物进行定量的专用 软件。因此，基于 Matlab（7.1 版）平台，我们研究开发了适用于批量代谢产物 定量的工具（batched metabolite quantification tool, BQT）,已获得软件著作 权（2011SR081319）。该软件具有以下特点：可根据每个标准品的峰强度和 浓度值自动建立标准曲线，并利用标准曲线计算批量样本中相应代谢物的浓度。可对多个代谢物同时进行定量，便于互相比较。软件支持excel格式文档 的导入和导出，简单易用。用户可通过图形用户界面对标准曲线进行手动修 改并实时查看更新后的结果。软件提供对数

10、变换和缺失值填补等基本的数据 预处理功能。1 对象与方法1.1 化合物定量原理 将标准品配制成不同浓度的标准品系列进行测定。用目标化合物的峰强度（峰面 积或峰高）与其对应浓度绘制标准曲线，计算该化合物标准曲线的线性度（R2）和 线性回归方程（y二ax+b，其中y为峰强度，x为浓度，a为回归系数，b为常 数）。在与测定标准曲线完全相同的实验条件下，测量样本中各组分的峰强度 （峰面积或峰高），将峰强度值代入相应化合物的线性回归方程，计算样本中该 组分的浓度。1.2 关键算法1.2.1自动拟合软件自动拟合的关键在于对每个物质合适的浓度点（x值）的选择。 首先对所有浓度点进行线性拟合，计算线性相关系数

11、（R2值）。若R2V0.999， 最远离拟合曲线的点将被移除。重新计算R2值，若R2V0.999，重复上述移除 步骤，直至R2A0.999。保留该情况下的浓度点和线性回归方程。当浓度点被 剔除到只剩5个，而R2V0.999时，则保留最大R2值和线性回归方程。1.2.2 对数变换 由于标准曲线的浓度梯度一般采用等比稀释，绘制拟合曲线时 浓度点的分布有可能不均匀，高浓度点会对拟合曲线产生较大影响。对数变换 可以有效降低其对回归方程的影响，使各浓度点的分布和权重更均匀、合理； 此外，当目标物质的浓度范围较大时，其浓度与峰强度不再是简单的线性关系。 采用对数变换有助于使浓度与峰强度的关系更清晰，提高线

12、性度。1.2.3 缺失值填补 当物质在样本中浓度过低时，定量的结果可能为负数；对此， 软件提供缺失值填补功能。采用相应物质在其他样本中定量结果均值的 1/10 替代这些零值或负值，以保证后续分析顺利进行。1.3 实验范例采用气相色谱飞行时间质谱联用平台 (gas chromatography time of flightmass spectrometry, GC-TOFMS)测定一组病例(n=45)和正常对照(n=45)的临 床血清样本，对其中的 40 个目标代谢物进行靶向代谢组学检测，采用本软件 进行代谢物的批量定量。1.3.1标准品配制将40种代谢物的标准品混合，用水/甲醇稀释成0.15、

13、0.3、0.75、1.5、3、7.5、15、30、70. 150 pg/mL系列浓度，待测。1.3.2 样本前处理 在与配制混合标准品完全相同的实验条件下处理血清样本。以氯苯丙氨酸和十七酸为内标，氯仿：甲醇(1:3, V/V)混合溶剂进行提取分离， 用N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)和三甲基氯硅烷(TMCS)为衍生试 剂，参照相关文献22方法进行样本衍生。1.3.3仪器条件与参数采用Agilent 6890N气相色谱Pegasus HT飞行时间质 谱联用仪（Leco，美国）进行测定，DB-5MS毛细管柱（Agilent J&W Scientific, 美国），载气为氦气，GC

14、采用程序升温，MS选择全扫描模式22。1.3.4测量和定量计算 测量：相同的仪器状态和参数设置，混合标准品和样 本等体积进样测定，所得的图谱采用 ChromaTof 软件进行预处理和峰面积提 取。采用自主开发的代谢组学数据校正工具 （metabolic data calibration tool,MDCT）对数据进行校正。结果按照规定格式整合成excel文档。混合标准 品测定结果的文档包括 40 种代谢物的名称和序号、10 个浓度梯度以及不同浓 度下各个代谢物的峰强度值 （此处选用峰面积 ）。样本测定结果的文档包括代谢 物的名称和序号、样本序号及其相应的峰强度值（峰面积）。定量计算：运行 软件

15、，导入混合标准品测定结果的 excel 文档（图 1）。如需对数据进行对数变换， 选中主界面中相应选项。对数变换的公式为log（y+c），只有一个可选参数c，c 一般设置为一个小于其他强度的值，用于防止零值对对数变换的影响，默认值 是 0.001。由于该范例中峰强度与浓度的线性关系较好，没有采用对数变换功 能。如果需要可以采用对数转换功能。2结果2.1 标准曲线的建立软件提供2种线性拟合方法，即自动拟合和手动拟合。选中STD选项，软件会 自动拟合，建立 40 种代谢物的标准曲线。可以直接采用该结果进行样本中代 谢物含量的计算，也可以查看该结果并进行手动修改 （主要是调整浓度点的纳入 和剔除）。

16、手动调整标准曲线的主界面如图 2 所示。图 2A 是自动拟合的结果， 图2B是手动剔除150 pg/mL浓度点的结果。一旦在该界面中勾选或剔除浓度点，回归曲线、线性方程和相关系数 R2 值都会自动更新。标准曲线建立后， 结果自动导出为excel文档。文档中包含了回归方程（y=ax+b）的系数值（a、b）、 线性相关系数（R2值）、浓度点的纳入和剔除情况、纳入浓度点的个数（N）以及 每个物质线性范围的上/下限（图 3）。2.2 定量计算结果导入样本测定结果的 excel 文档，选用手动调整后的标准曲线对样品中的代谢 物进行定量计算。样本的定量结果自动导出为 excel 文档，格式与导入的文档 相同，但 90 个样本中的 40 个组分的峰强度值均被定量后的绝对浓度值替代 （图 4）。3讨论3.1 手动拟合的