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1、酶的分别纯化需要考虑的几点：1、目标酶分子特性及其他物理、化学性质；2、酶分子和杂质的主要性质差异；3、酶的使用目的和要求；4、技术施舍的难易程度 5、分别本钱的凹凸； 6、是否会造成环境污染。诱导作用：参加某些物质使酶的生物合成开头或加速进展的现象，称为酶生物合成的诱导作用。无诱导物时，调整基因产生的阻遏蛋白与操纵基因的结合较强。由于 RNA 聚合酶的结合位点与阻遏蛋白的结合位点相互重叠，当他们结合时，就把 RNA 聚合酶结合部位掩盖起来， 在空间上排挤 RNA 聚合酶，使之脱离启动基因部位，使构造基因无法进展转录，酶的生物合成受阻。不能转录阻遏现象：酶催化反响的产物或代谢途径的末端产物使该
2、酶的生物合成收到阻遏。在没有阻遏物存在时，调整基因产生的阻遏蛋白与操纵基因的亲和力弱，不能与操纵基因结合，所以 RNA 聚合酶可以结合到其在启动基因的位点上，进展转录，而合成构造基因所对应的酶。能够转录当环境中色氨酸浓度增加，阻遏物到达肯定浓度时，阻遏蛋白与阻遏物结合，使其构造发生转变，从而使阻遏蛋白与操纵基因的结合力增加。阻遏蛋白与操纵基因结合，就排挤 RNA聚合酶与启动基因的结合，使转录无法进展，酶的生物合成因此受到阻遏。酶生物合成的模式：同步合成型、连续合成型、中期合成型、滞后合成型同步合成型生长偶联型：是酶的生物合成与细胞生长同步进展的一种酶生物合成模式。特点：在细胞进入生长期时，酶大
3、量合成、不受阻遏作用。连续合成型局部生长偶联型：是酶的生物合成在细胞的生长阶段开头，在细胞生进步入平衡期后酶还可以合成一段时间的一种酶生物合成模式。特点：在细胞进入平衡期还可以合成一段时间、受诱导物作用，不受阻遏物作用、 mRNA相当稳定。中期合成型生长偶联型：在细胞生长一段时间后才开头，而在细胞生进步入平衡期以后， 酶的生物合成也随之停顿。特点：酶的生物合成受到产物的反响阻遏作用或分解代谢物阻遏作用，而酶所对应的 mRNA稳定性差。滞后合成型非生长偶联型：酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开头其生物合成大量积存。特点：受到培育基中存在的阻遏物的阻遏作用、mRNA 稳定性好。酶所对应的
4、 mRNA 稳定性以及培育基中的阻遏作用是影响酶的生物合成的主要因素。在酶的发酵生产中，最抱负的合成模式是连续合成型。其中对于同步合成型的酶，要尽量提高其对应的 mRNA 的稳定性，为此适当降低发酵温度是可取的措施；对于滞后合成型的酶， 要设法降低培育基中阻遏物的浓度，尽量削减甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使 酶的生物合成提早开头；而对于中期型的酶，则要在提高 mRNA 的稳定性以及解除阻遏， 使其是生物合成的开头时间提前，并尽量延迟其生物合成停顿时间。微生物保藏方法：斜面保藏法 、沙土管保藏法、真空冷冻枯燥保藏法 、低温保藏法、石蜡油保藏法。细胞活化：保藏的菌种在用于发酵生产之前，必
5、需接种于颖的固体培育基上，在肯定的条件下进展培育，使细胞的生命活性得以恢复。培育基：是指人工配制的用于细胞培育和发酵的各种养分物质的混合物。扩大培育留意事项：1、氮源丰富 2、培育到对数生长期，准时培育到发酵罐中 3、削减传代次数，降低菌种衰退和污染的可能 4、严格把握培育温度、pH、溶氧量。耗氧速率 Ko2：指的是单位体积培育液中的细胞在单位时间内所消耗的氧气量。Qo2：是指单位细胞量在单位时间内的耗氧量。细胞呼吸强度 Cc:指的是单位体积培育液中细胞的量。Ko2=Qo2Cc溶氧速率 Kd：是指单位体积的发酵液在单位时间内溶解氧的量。调整溶解氧的方法：1、调整通气量 2、调整氧的分压 3、调
6、整气液接触时间 4、调整气液接触面积 5、转变培育基的性质提高酶产量的措施：1、添加诱导物 2、把握阻遏物的浓度 3、添加外表活性剂 4、添加产酶促进剂 5、基因突变提高酶产量固定化细胞：又称为固定化活细胞或固定化增殖细胞，指实行各种方法固定在载体上，在一定的空间范围进展生长、生殖和陈代谢的细胞。固定化细胞发酵产酶的特点：1、提高产酶率 2、可以反复使用或连续使用较长时间 3、基因工程菌的质粒稳定，不易丧失 4、发酵稳定性好 5、缩短发酵周期，提高设备利用率 6、产品简洁分别纯化 7、适用于胞外酶等胞外产物的生产固定化细胞发酵产酶的工艺条件及把握：1、固定化细胞的培育 2、溶解氧的供给 3、温
7、度的把握 4、培育基的组分把握固定化原生质体的特点：1、变胞内产物为胞外产物 2、提高酶产率 3、稳定性好 4、易于分别纯化固定化原生质体发酵产酶的工艺条件及其把握：1、渗透压的把握 2、防止细胞壁再生 3、保证原生质体的浓度端粒酶：是催化端粒合成和延长的酶，是一种核糖核蛋白，包含蛋白质和 RNA 两种根本成分。在合成端粒的过程中，端粒酶以其本身的 RNA 组分作为模板把端粒重复序列加到染色体 DNA 的末端，使端粒延长。端粒延长主要包括三个步骤：1、结合：端粒酶分子的 RNA 重复序列与 DNA 端粒末端依据互补配对原则 2、延长：以端粒酶分子的 RNA 为模板，通过反转录作用，使 DNA
8、分子上的端粒延长 3、移位：端粒酶移动到延长后的独立末端。重复上述过程，反复进展，使端粒不断延长。基因扩增是通过增加基因数量来调整基因表达的一种方式。它可以发生在个体发育的某一阶段或在细胞分化的某一过程。增加子：又称调变子，是一段能高效增加或促进基因转录的 DNA 序列。抗体酶：又称为催化性抗体，是一类具有生物催化功能的抗体分子。抗体酶的制取方法有诱导法和修饰法。修饰法是对抗体进展分子修饰，在抗体与抗原的结合 部位引进催化基因而成为抗体酶的方法；诱导法是利用特定的抗原诱导抗体酶合成的方法。植物细胞培育产酶的特点：1、提高产率 2、缩短周期 3、易于治理，减轻劳动强度 4、提高产品质量 5、具有
9、对剪切力敏感、生长周期长，很多植物细胞的生长和代谢需要肯定的光照。植物细胞培育产酶的工艺过程：1、外植体的选择和处理 2、植物细胞的猎取直接分别法机械法和酶解法 愈伤组织的诱导法 原生质再生法 3、细胞悬浮液培育 4、分别纯化植物细胞培育产酶的工艺条件及其把握：培育基的配制 把握：1、温度的把握 2、pH 的把握 3、溶解氧的调整把握 4、光照的把握 5、前提的添加 6、刺激剂的应用动物细胞培育具有如下特点：1、动物细胞培育主要用于各种功能蛋白质和多肽的生产 2、动物细胞的生长缓慢 3、为了防止微生物污染，在培育过程中需要添加抗生素 4、动物细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感 5、大多数细
10、胞具有锚地依靠性，适宜承受贴壁培育6、动物细胞培育基成分简单，一般要添加血清或其代用品 7、原代细胞继代培育 50 代后， 即会退化死亡，需要重分别细胞动物细胞培育产酶的工艺过程及其把握：1、悬浮培育 2、贴壁培育 3、固定化细胞培育、分别和纯化 4、培育基组成成分 5、培育基的配制 6、温度的把握 7、pH 的把握 8、渗透压的把握 9、溶解氧的把握细胞裂开法：1、机械裂开法 2、物理裂开法 3、化学裂开法 4、酶促裂开法机械裂开法：捣碎发、研磨法、匀浆法 原理：通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞裂开物理裂开法：温度差裂开法、压力差裂开法、超声波裂开法 原理：通过各种物理因素的作用，使组
11、织、细胞的外层构造破坏，而使细胞裂开化学裂开法：添加有机溶剂、添加外表活性剂 原理：通过各种化学试剂对细胞膜的作用， 从而使细胞裂开酶促裂开法：自溶法、外加酶制剂法 原理：通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用， 使细胞外层构造受到破坏，从而到达细胞裂开。酶的提取：是指在肯定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程，也称酶的抽取。酶的主要提取方法：盐溶液提取 酸溶液提取 碱溶液提取 有机溶液提取盐溶液提取：用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取：用于提取在稀酸溶液中溶解度大且稳定性较好的酶碱溶液提取：用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机
12、溶液提取：用于提取那些与脂质结合结实或含有较多非极性基因的酶盐溶：大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随浓度的上升而增加，这种现象叫盐溶现象。盐析：当盐浓度到达某一界限后，酶的溶解度随盐浓度上升而降低的现象，这称为盐析现象。沉淀分别法：盐析沉淀法：利用不同蛋白质在不同的特性，通过在酶液中添加肯定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中洗出沉淀，从而使酶与杂质分别。等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调整溶液的 pH，使酶或杂质沉淀析出，使酶或杂质分别。有机溶剂沉淀法：利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过
13、添加肯定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分别。复合沉淀法：在酶液中参加某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分别。选择性变形沉淀：选择肯定条件使酶液中存在的某些杂质变形而沉淀而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分别出来。过滤：借住过滤介质将不同大小、不同外形的物质分别的技术过程。非膜过滤：承受高分子膜以外的材料，如滤纸、滤布、纤维、多空陶瓷、烧结金属等作为过滤介质的分别技术称为非膜过滤，包括粗滤和局部微滤。膜分别技术：借住肯定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同外形和不同特性的物质颗粒或分子进展分别的技术称为膜分别技术。在酶生产中的应用：在酶分别纯化过程中，可以除
14、去酶液中含有的微生物细胞，还能到达酶液浓缩的目的，使用与酶制剂的生产，还可用于酶液的脱盐。层析分别方法：吸附层析法：利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物种各组分分别安排层析法：利用各组分在两相中的安排系数不同而使各组分分别离子交换层析：利用离子交换剂上的可解离基团对各种离子的亲和力不同而到达分别目的 凝胶层析：以各种多孔凝胶为固定相，利用流淌相中所含各种组分的相对分子质量不同而到达物质分别亲和层析：利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分别纯化层析聚焦：将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分别萃取：有机溶剂萃取、双水相萃取、超临界萃取
15、、反胶束萃取有机溶剂萃取：有机溶剂萃取的两相分别为水相和有机溶剂相，利用溶质在水和溶剂中的溶解度不同而到达分别。双水相萃取：双水相萃取的两相分别为互不相溶的两个水相。利用溶质在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而到达分别超临界萃取：又称为超临界流体萃取，是利用欲分别物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而到达分别的一种萃取技术反胶束萃取：利用反胶束将酶或其他蛋白质从混合液中萃取出来的一种分别纯化技术。结晶：盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶法、等电点结晶法盐析结晶法：在适当的温度和pH 等条件下，于接近饱和的酶液中缓慢增加某种中性盐的浓度，使酶的溶解度渐渐降低，到达略微过饱和状态，析出酶晶体
16、的过程。有机溶剂结晶法：在接近饱和的酶液中渐渐参加某种有机溶剂，使酶的溶解度降低，析出酶晶体的过程。透析平衡结晶法：将酶液装进透析袋，对肯定浓度的盐溶液进展透析，使酶液逐步到达过饱和状态而析出晶体的过程。等电点结晶法：通过缓慢转变浓酶液的pH 使之到达渐渐到达酶的等电点，从而使酶析出结晶的过程。枯燥：真空枯燥、冷冻枯燥、喷雾枯燥、气流枯燥、吸附枯燥酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的构造发生某种转变，从而转变酶的催化特性的技术过程。作用：通过酶分子修饰，可以使酶分子构造发生某些合理的转变，就有可能提高酶的催化效率、增加酶的稳定性、降低或消退酶的抗原性、转变酶的底物专一性等。同时通过酶分子修饰，争辩和了解酶分
