《第五章 色谱法-2.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第五章 色谱法-2.doc（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、4 高效液相色谱法一、概述1、定义在经典液相色谱法基础上，吸收了气相色谱法的理论，并采用高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的色谱技术称为高效液相色谱法，又称为高压液相色谱法。2、特点高压 由于液体的粘度比气体大得多，所以，当液体流动相通过色谱柱时会受到很大的阻力，需采用高压泵对载液施加压力，压力可达100350105Pa。高速 流动相在柱中的流速大，分离速度快，一次分析只需几分钟至几十分钟就能完成。分析时间比经典液相色谱法短得多，与气相色谱法近似。高效 使用了新型固定相，柱效远高于气相色谱法。另外，流动相可进行选择，有单溶剂、多元溶剂，并可任意调配比例，可改变流动相的组成、极性、pH
2、值等性质，因此改善了分离效果。而气相色谱法的流动相种类少，性质相近，且与组分之间不发生特殊作用，故改变载气种类不能很大地改善分离效果。该法分离温度远低于气相色谱法，更有利于分离。高灵敏度 采用高灵敏度的检测器，提高了分析灵敏度，如紫外检测器的灵敏度可达51010gmL1。应用范围广 一般对能制成溶液的试样均能分析，尤其适用于分析高沸点、大分子、热稳定性差、强极性化合物和各种离子型化合物，如分离分析氨基酸、蛋白质、维生素、生物碱、糖类、农药等。而气相色谱法无法分析高沸点（300以上）或不能汽化的物质。液相色谱易实现分离后样品中各组分的收集（高纯物制备）。二、 高效液相色谱仪高效液相色谱仪包括高压
3、输液泵、梯度淋洗装置、进样装置、色谱柱、检测器和记录系统，见图。贮藏器中贮存的流动相经过高压泵送到色谱柱冲洗柱子，当柱子平衡而且基线平直后，试样用注射器进入进样口，由流动相把试样送到色谱柱进行分离，分离后的组成由检测器检测，输出的信号通过放大器放大后用记录仪记录下来。若需进行进一步分析，在色谱柱出口可将流出物收集起来。1、高压输液泵高压输液泵是用来输送流动相的，它是高效液相色谱仪的重要部件。按泵的性质分为恒流泵和恒压泵两类。恒流泵： 恒流泵是目前使用最多的，有往复泵和螺旋泵。往复泵使用广泛，它的优点是输出流量恒定，且与流动相的粘度及色谱柱的阻力无关，死体积小，保留值的重复性好，并适合于梯度淋洗
4、，缺点是输出液流量有脉动。 恒压泵： 常用的恒压泵为气动放大泵，输出压力恒定，流量无脉动，能迅速获得高压，适合于色谱柱的填充，价格低；缺点是流量与流动相粘度和色谱柱的阻力有关，所以流量不恒定；泵的腔体大，改变流动相较麻烦，不适宜于梯度淋洗。2、梯度淋洗装置对于某些复杂样品，组分的值范围很宽，用一种强度的溶剂淋洗时往往不能满足要求，可采用梯度淋洗即在分离过程中，组成流动相的两种或两种以上不同的溶剂，按一定程序连续改变配比、极性、pH值和离子强度，从而达到提高分离效果和分析速度的目的，梯度洗脱技术类似于气相色谱中的程序升温技术。两者都是为了使各组分在最佳值下流出柱子（不同的是程序升温通过改变柱温，
5、而梯度淋洗是通过改变流动相）。梯度淋洗有两种装置：一种是低压梯度，在常压下按一定程序将不同的溶剂混合后再用高压泵输入色谱柱；另一种是高压梯度，用两个高压泵将不同的溶剂按一定比例压入混合室混合，再送入色谱柱。3、进样装置将样品送入色谱柱中进行分离。由于高效液相色谱柱子较短（一般小于0.3m），固定相颗粒较细，进入柱中的样品在流动相中扩散越厉害，则色谱峰就越宽，因此，进样时要求样品在到达柱头前，不与流动相相混合，直接注射到柱头中心即所谓“点进样”。进样方式通常有两种：一种是注射器进样，同气相色谱法，优点是装置简单，可改变进样量，缺点是不能承受高压；另一种是进样阀进样，与气相色谱法中的六通阀一样，优
6、点是能承受高压，重现性好，易于自动化，缺点是改变进样体积时较麻烦。4、色谱柱色谱柱是色谱分离的核心。常采用填充柱，固定相同气相色谱法，此处介绍色谱柱管。要求柱管耐高压、耐腐蚀。一般采用厚壁的玻璃管或不锈钢管制成，柱内径为16mm，柱长为1530cm，直形柱。5、检测器检测器分为两类通用型检测器（总体性质检测器）：它是连续测定柱后流出液（流动相加溶质）总的物理性质的变化，如示差折光检测器、电导检测器等。因适用范围广，但是由于它对溶剂（流动相）也有响应，因此易受温度、流量变化的影响，造成较大的噪声和漂移，不能用于梯度淋洗，灵敏度较低，不适于痕量分析。选择性检测器（溶质性质检测器）：它是测定流出液中
7、溶质（待测组分）的物理性质的变化，对流动相无信号，如紫外吸收检测器和荧光检测器等。这类检测器只对某些待测物质有响应，灵敏度高，受外界影响小，可用于梯度淋洗，但应用范围受限制。a、紫外可见吸收检测器高效液相色谱仪中使用最广泛的选择性检测器。作用原理是待测组分对特定波长的紫外或可见光有选择性吸收，适合于紫外或可见光区有吸收的溶质的测定。检测器输出信号的大小即吸光度与组分浓度成正比。分有固定波长和可变波长两类优点：灵敏度高；选择性好；对流量和温度的变化不敏感，适用于梯度淋洗；线性范围宽（达105），能同时检测主要成分和痕量成分。缺点是只适用于检测能吸收紫外、可见光的物质，要求流动相在测定波长下不能有
8、吸收。b、示意折光检测器示差折光检测器是通用型检测器，作用原理是连续地监测纯流动相和包含样品的流动相之间折射率的差值来测定试样的浓度，只要纯流动相与待测组分的折射率不同，检测器就会给出检测信号，其响应信号的大小与样品含量呈正比。按结构、原理不同可分为偏转型和反射型两种。优点是通用常性强，只要折射率与流动相不同的物质都可检测，不破坏样品，操作简便，线性范围宽；它的缺点是灵敏度较低，不适宜于痕量分析，折射率随温度变化，不能用于梯度淋洗。c、荧光检测器荧光检测器是选择性检测器。作用原理是:具有特殊结构的化合物受紫外光激发后，发射出比吸收的紫外光波长较长的光，即荧光，荧光强度与物质的浓度呈线性关系。荧
9、光检测器特别适合于芳香族化合物、生化物质的检测，如有机胺类、氨基酸、维生素、激素、甾族化合物、酶等。优点是灵敏度极高，比紫外吸收检测器高101000倍，特别适合于痕量分析；线性范围较宽，但比紫外吸收检测器窄；受外界条件影响小，可用于梯度淋洗。缺点是由于是选择性检测器，应用范围受到限制；样品浓度较高时，荧光强度与浓度不再呈线性关系；对影响荧光测量的一些干扰（如背景荧光等）非常敏感。三、高效液相色谱法的类型及应用根据分离机理的不同，高效液相色谱法分五类：液固吸附色谱法、液液分配色谱法、化学键合相色谱法、离子交换色谱法和凝胶色谱法。1、高效液相色谱法的固定相和流动相A、固定相高效液相色谱法所用的固定
10、相按所承受的压力可分为硬胶、半硬胶或软胶三种。在前三种色谱类型中使用硬胶固定相，离子交换色谱中常常使用半硬胶，而在凝胶色谱中，硬胶、半硬胶和软胶固定相都可使用。固定相按孔隙深度又可分为表面多孔和全多孔型。表面多孔型的基体是球形玻璃珠，在玻璃表面涂敷一层多孔活性物质一如硅胶、氧化铝、离子交换树脂、分子筛等，也可以制成化学键合固定相，这种固定相的多孔层薄、孔浅、传质速度快，适合于快速分离，填充均匀紧密，机械强度高，能承受高压，适合于较简单的样品及常规分析。全多孔型固定相比表面积大，柱容量大；小颗粒全多孔型固定相孔洞浅，传质速度仍很快，柱效高，分离效果好，适合于复杂样品、痕量组分的分离分析，这类固定
11、相应用最广泛的。B、流动相在高效液相色谱中，当柱子和待测样品给定以后，选择什么样的溶剂作流动相，直接影响组分的分离度。通常需考虑作流动相的溶剂的物理性质（如沸点、紫外吸收等）和溶剂强度以及溶剂的种类和配比。因此，对作流动相的溶剂有如下要求。（1）对待测样品有足够的溶解能力。（2）与检测器要匹配 需考虑溶剂的物理性质对检测结果的影响。例如使用紫外可见吸收检测器时，所使用溶剂的截止波长必须小于检测波长；若使用折光检测器时，应选择与试样折射率相差较大的溶剂。（3）纯度要高 通常采用分析纯溶剂，必要时可采用蒸馏等预处理方法进行进一步纯化，所用溶剂还应不与样品、固定相发生反应，本身不发生聚合、变质。（4
12、）粘度要低 溶剂粘度低，有利于分离。若溶剂粘度高，传质速度缓慢，柱效下降；粘度太低的溶剂沸点低、易挥发，在色谱过程中易产生气泡。通常选择沸点比分析温度高2050的溶剂。（5）在使用前需脱气 由于柱前和柱后压力相差较大，溶解在溶剂中的气体将以气泡形式逸出，干扰高压泵和检测器正常工作，因此常采用加热回流法、抽真空脱气法、超声波处理法等对溶剂进行预先脱气处理。2、液固吸附色谱法A、分离原理液固吸附色谱基于固体吸附剂表面对不同物质吸附能力不同使混合物分离的。当流动相经过色谱柱时，吸附剂表面的活性中心就要吸附溶剂分子，而当流动相携带着样品进入柱子时，样品分子就要取代吸附剂表面上的溶剂分子，从而在吸附剂表
13、面上发生了竞争吸附即样品分子与溶剂分子的竞争，样品中带有不同官能团的各种组分分子的竞争。各组分分子对吸附剂表面活性中心的竞争能力的大小，决定了它们的保留情况，被吸附剂吸附得越牢的组分，越不易被流动相洗脱下来，保留时间越长，反之，保留时间短，从而使混合物中各组分得到分离。B、固定相液固色谱法所用的固定相有硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等，目前液固色谱常使用硅胶，极性样品分子和碱性物质优先保留，后出峰。C、流动相流动相主要是非极性的烃类（如己烷、庚烷），并在其中加入少量的极性溶剂作为缓和剂（如水、二氯甲烷、甲醇等），极性越大的组分保留时间越长。选择液固色谱流动相时可参照溶剂强参数（可从手册中查得），
14、越大，溶质的吸附越弱，溶剂的洗脱越强。D、应用液固吸附色谱选择性好，最大允许样品量较大，在分离几何异构体、族分离和制备色谱等方面具有独特的意义，还可用于分离偶氮染料、维生素、甾族化合物、多核芳烃、脂肪、油类、极性较小的植物色素等。3、液液分配色谱法A、分离原理液液分配色谱法的固定相和流动相都是液体。当带有待测试样的流动相进入色谱柱时，溶质分子溶解到两种液相中（流动相与涂在载体上的固定液相互共存但互不相溶），并很快达到分配平衡，由于试样中各种组分在二液相中分配系数的不同而达到分离。固定相是极性的、流动相是非极性的液液分配色谱称为正相分配色谱，它适于分离极性化合物，由于分子的作用力主要是静电力，所
15、以正相分配色谱的分离顺序是非极性、弱极性、强极性；流动相的极性增加，洗脱能力增强。固定相是非极性的、流动相是极性的液液分配色谱称为反相分配色谱，它适于分离极性较弱的化合物，分离顺序是极性较强的组分先出峰；流动相极性减弱，洗脱能力增强。B、固定相液液分配色谱所用的固定相是把固定液涂在很细的载体上。常用的固定液只有几种极性不同的物质，如，一氧二丙腈、聚乙二醇、聚酰胺、正十八烷和异三十烷等。C、流动相为使流出组分的在110之间，应选择合适的溶剂强度，即溶剂的极性、pH值、离子强度等，一般根据经验、参考文献、实验来进行选择。为了避免固定液溶解于流动相中而流失，选择的流动相与固定相的极性总是相反的，若用极性较强的或亲水性物质为固定相，应以极性较弱的或亲脂性溶剂为流动相；若用非极性或亲脂性物质为固定相，则应以极性较大的亲水性溶剂为流动相。为了获得合适的溶剂强度，常采用两种或两种以上的溶剂作流动相。D、应用液液分配色谱法适用的样品类型广，最适合同系物组分的分离，例如它能分离水解蛋白质所生成的各种氨基酸，分离脂肪酸同系物等。由于涂敷在载体上的固定液易流失，重现性差，且不适合于梯度淋洗和采用高速流动相。4、化学键合相色谱法A、化学键合相色谱化学键合相色谱是采用化学键合固定相的色谱技术。利用化学反应将固定液键合到载体表面上。化学键合相色谱在高效液相色谱的整个应用中占80%以上。
