《高效液相色谱HPLC操作步骤及问题集锦》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高效液相色谱HPLC操作步骤及问题集锦（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、等浓度洗脱：开机步骤：1. 配有机相，体积2200ml （空瓶子先装满肥皂水超声10min,再用自来水冲洗10次，蒸馏水洗 4 次），砂滤（用有机膜，光面向上，瓶中液体快到瓶口时放气防止倒吸），室温超声10min。开电源总开关，开计算机，开柱温箱开关，开SPD-15C开关，LC-15C开关。2. 开purge阀，把A管从纯甲醇中取出，靠壁几秒后放入有机相中，purge，绿灯闪后关 purge 阀，把废液瓶放地上。3. 打开软件,系统设置:确认添加LC-15C（A），确认柱温箱为（室温较低35C,室温较高30C）简单设置：LC时间：60min波长：215nm模式:等浓度洗脱总流速：0.6ml/m
2、in下载（有机相较少时改流速为0.5ml/min ）点泵开关走基线60min，拔六通阀处塞子和橡胶帽。（若压力线与基线相差过大，则点击显示设置，修改强度范围，再点击检测器零点，快走 平时调回原来的强度范围）4. 基线走完，不关泵开关，点击单次运行，改文件名和存储位置。5. 纯甲醇洗针三次，每次60ul；取待测样品，用0.22um滤膜过滤至2ml EP管中，每针进 样量:40ul。若管中出现气泡，则拉活塞使气泡变大，用纸捏住针头，推活塞把气泡打入纸 中再进样。6. 进样时，先将针插入六通阀中快而匀速的将活塞推到底，再掰下阀，则仪器自动开始走线。 关机步骤：方法一：1. 测样结束，点击停止，关泵开
3、关，待压力降为0,开purge阀，将A管从有机相中取出， 靠壁几秒后放回纯甲醇中，purge，绿灯闪后关purge阀。2. 简单设置：总流速：1.0ml/min下载点泵开关，洗脱柱子 30min3. 在开始洗柱子时，用纯甲醇洗针三次，每次60ul；用针吸取纯甲醇洗六通阀，每次60ul, 将针插入六通阀，推进活塞后掰下阀，间隔0.5min,把阀掰上，再洗下一针，重复洗三次， 等待洗脱柱子完成。（纯甲醇当天用不完的应丢弃）4黑线走平，即表明洗脱柱子结束，关泵开关，收针，塞回塞子和橡胶帽，关软件，关LC-15C 开关，关SPD-15C开关，关柱温箱开关，关机，关电源总开关。5. 洗废液瓶、废液缸。方
4、法二：1. 测样结束，关泵开关，待压力降为0,开purge阀，将A管从有机相中取出，靠壁几秒后 放回纯甲醇中，purge，绿灯闪后关purge阀。2. 简单设置：总流速：1.0ml/min下载3. 关软件，关 SPD-15C 开关左侧控制面板点击“PUMP”，洗针步骤同上4. 30min洗柱结束后，摁“PUMP”关泵开关，收针，塞回塞子和橡胶帽，关LC-15C开关, 关柱温箱开关，关机，关电源总开关。5. 洗废液瓶、废液缸。方法三：1. 测样结束，关泵开关：左侧控制面板点击“PUMP”，将阀往上推2. 调流速：Func连续摁直到出现“system change”，1为local，enter确定
5、，摁CE退回到主界面。再次摁 Func 使主界面光标移动，数字键盘输入 1.0ml/min， enter 确定。3. 待压力降为0,开purge阀，将A管从有机相中取出，靠壁几秒后放回纯甲醇中，purge， 绿灯闪后关 purge 阀。4. 摁PUMP洗脱柱子30分钟，洗针步骤同上。5. 30min洗柱结束后，摁“PUMP”关泵开关，收针，塞回塞子和橡胶帽，关LC-15C开关，关柱温箱开关，关机，关电源总开关。6. 洗废液瓶、废液缸。二元梯度洗脱：开机步骤：1.配有机相、纯水相，体积2200ml （空瓶子先装满肥皂水超声10min，再用自来水冲洗10 次，蒸馏水洗4次），砂滤（用水膜/有机膜，
6、光面向上，瓶中液体快到瓶口时放气防止倒吸）， 室温超声10min。开电源总开关，开计算机，开柱温箱开关，开SPD-15C开关，LC-15C开关，LC-15C 开关。2把A管从纯甲醇中取出，靠壁几秒后放入有机相中，开purge阀，purge，绿灯闪后关purge 阀，把B管从纯甲醇中取出，同样靠壁几秒后放入纯水相中，开purge阀，purge，绿灯闪 后关 purge 阀。3. 打开软件，系统设置：确认添加LC-15C（A）, LC-15C（B）,确认柱温箱为（室温较低35C, 室温较高30C）简单设置： LC 时间： 60min波长： 215nm走基线时前20分钟：模式：等浓度洗脱泵 A 流速
7、：0.6ml/min泵B流速：0.4ml/min下载走基线后40分钟：模式：二元梯度洗脱总流速： 0.6ml/min泵B浓度：85%下载（有机相较少时改流速为0.5ml/min）点泵开关走基线60min，拔六通阀处塞子和橡胶帽。4. LC时间设置：设置需要的浓度梯度，注意前后浓度不一致时需平衡20min5. 基线走完,点击单次运行,改文件名和存储位置。6纯甲醇洗针三次，每次60ul；取待测样品，用0.22um滤膜过滤至2ml EP管中，每针进 样量:40ul。若管中出现气泡，则拉活塞使气泡变大，用纸捏住针头，推活塞把气泡打入纸 中再进样。7. 进样时，先将针插入六通阀中快而匀速的将活塞推到底，
8、再掰下阀，则仪器自动开始走线。 关机步骤：1. 测样结束，关泵开关，待压力降为0,将A管从有机相中取出，放回纯甲醇中，B管从纯 水相中拿出，放回纯甲醇中，开purge阀，purge，绿灯闪后关purge阀。2. 简单设置：模式：等浓度洗脱总流速 ： 1.0ml/min 泵 A 浓度： 0.4ml/min 泵B浓度：0.6ml/min下载点泵开关，洗脱柱子 30min3. 在开始洗柱子时，用纯甲醇洗针三次，每次60ul；用针吸取纯甲醇洗六通阀，每次60ul， 将针插入六通阀，推进活塞后掰下阀，间隔0.5min,把阀掰上，再洗下一针，重复洗三次， 等待洗脱柱子完成。（纯甲醇当天用不完的应丢弃）4.
9、 黑线走平，即表明洗脱柱子结束，关泵开关，收针，塞回塞子和橡胶帽，关软件，关 LC-15C、LC-15C开关，关SPD-15C开关，关柱温箱开关，关机，关电源总开关。5. 洗废液瓶、废液缸。注：甲醇截止波长：210nm乙醇截止波长： 190nm当样品的最大吸收波长220nm，用甲醇作为有机相（便宜）V220nm，用乙腈作为有机相对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。*当有机相比例减小10%时，极性变小，洗脱时间变长，应相应调长20min的LC停止时间和 结束时间。当降低检测器波长时（降到215nm），流动相从纯甲醇变为85%甲醇，走基线会出现鬼峰， 且很难走平当流动
10、相为80%甲醇时，出峰时间为22.5min，超过LC停止时间，则改变流动相为85%甲醇， 提前出峰时间本实验室所用液相型号：柱型： C18化学键合相色谱紫外检测器当点过单次运行，显示加入批处理队列时，点击“STOP”停止批处理队列，即可进样。明明有杂质却检测不出峰？1. 检测器是紫外检测器，而杂质可能几乎没有紫外吸收2. 有杂质的表现是压力线上移或者峰变形，而图显示峰变形，因此推测是较强的吸收峰将杂质包在里面而使得峰变形了为什么停止了单次运行后还能出峰但在再解析的图上却看不到停止之后这个峰？因为仪器只记录了停止运行前的数据，但之后检测器还是会进行检测，只是不再保存该数据现象类型基线漂移基线噪声
11、大可能的原因解决方法正方向：污染物积累/洗脱负方向（梯度型）：流动相“A ”溶剂有吸收正方向（梯度型）：流动相“B ”有吸收 正方向（梯度型）：流动相“B ”有吸收 随机性：温度变化清洗色谱柱，净化样品，用不吸光度或HPLC级试随机性：温度变化波浪形：室内温度变化系统没有平衡检测池中有气泡用不吸光或用更咼的紫外用不吸光或HPLC级溶剂将柱和管路绝缘保温 将柱和管路使用恒温柱箱 监测和控制室温 以10倍柱体积流动相平彳! 对流动相进行脱气,然后将 的坐高限压力更换保护柱使用合适的溶剂对色谱柱 根据说明书清洗检测池 使用新配制的HPLC级溶 一般当灯的使用时间超过 使用更纯的溶剂或者更咼 检查或更
12、换漏液管路或零 使用过程中，确保比例阀保护柱被污染色谱柱被污染检测器污染流动相污染检测器灯老化使用梯度方法系统漏液流动相混合不准确试剂瓶中过滤头堵塞过滤头用水超声，然后用检测器灯老化更换灯，特别是当灯的使随机性：污染物积累冲洗柱，净化样品，使用连续性：检测器灯故障更换紫外灯（寿命lOOOh偶然性：外界电干扰使用液相色谱专用电源稳尖峰：检测器气泡流动相脱气或反压调节器运行结束后，用强溶剂冲冲洗色谱柱以去除污染物 样品净化或预分离在实际应用的流动相中， 每天新配样品，使用抗氧 用不同量的水通过反相柱 的水溶剂脱气上次进样的残留污染样品中不明干扰物离子对：破坏平衡鬼峰肽谱：三氟乙酸氧化反相：水受污染
13、尖峰：溶剂中气泡进样量太大进样溶剂太强过滤砂芯堵塞柱有空隙火气沟存有未扫过的进样器流路双峰旧的保护住色谱柱被污染色谱柱塌陷柱头有空隙柱子进样量超载进样量应为流动相进样量使用较弱的进样溶剂或流 更换并用0.5“m孔隙的在 用玻璃珠或填料填满孔隙 更换进样器转子更换保护柱使用合适的溶剂对色谱柱 更换色谱柱，所使用的pH 用填充料或玻璃珠填充头 用更高负荷量的固定相 增大柱直径减少进样量净化样品，预分离参阅上面的方法减少接头的数量 保证进样器密封完好 保证接头位置合适单峰：存在干扰成分峰拖尾双峰的开始存在未扫的死体积碱性化合物：硅醇相互作用换成高聚物固定相用更强的流动相或加竞争碱性化合物：硅醇相互作
14、用使用特种色谱柱，高聚物硅胶基：柱降解向流动相中加盐增加缓冲 用pH耕地的流动喜爱那个硅胶基：硅醇相互作用更换保护柱确保样品溶剂低于或者等旧的保护柱减少进样体积，避免样品减少进样浓度，避免样品样品溶剂过强使用适当的溶剂冲洗色谱 旧的色谱柱比新的色谱柱进样体积过大进样浓度过大色谱柱被污染旧的色谱柱色谱柱塌陷更换色谱柱，所使用的pH系统没有平衡以10倍柱体积流动相平彳!样品溶剂过强确保样品溶剂低于或者等进样量过大减少进样体积，避免样品减少进样浓度，避免样品峰形展宽进样浓度过大减少进样管路的直径和长柱外死体积过大温度波动使用恒温控制的柱温箱，更换保护柱旧的保护住使用过离子对试剂的色谱旧的色谱柱旧的色谱柱比新的色谱柱 使用适当的溶剂清洗色谱污染的色谱柱更换色谱柱，所使用的pH 在进样前后引入气泡以降色谱柱塌陷在进样阀中峰分散 数据采集速率太慢 检测器时间常数慢 流动相黏度太高 检测器容积太大 保留时间长增加采样频率调节时间常数使之与峰宽 增加柱温用尽可能小的池溶剂
