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1、酶生物传感器的应用进展摘要：酶生物传感器是将酶作为生物敏感基元,通过各种物理、化学信号转换器捕捉目标物与敏感基元之间的反应所产生的与目标物浓度成比例关系的可测信号,实现对目标物定量测定的分析仪器。与传统分析方法相比,酶生物传感器具有独特的优点:选择性高、 反复多次使用、响应快、体积小、可实现在线监测、成本低，便于推广普及。本文主要论述生物酶传感器的特征、发展及酶传感器中应用的新技术。关键词：酶生物传感器;进展;应用新技术1概述生物传感器(Biosensor)是一类特殊的化学传感器,通过各种物理、化学型信号转换器捕捉目标物与敏感基元之间的反应,然后将反应的程度用离散或连续的信号表达出来,从而得出
2、被测物的浓度1。自1962年Clark2等人提出把酶与电极结合来测定酶底物的设想后，1967年Updike和Hicks3研制出世界上第一支葡萄糖氧化酶电极2，用于定量检测血清中葡萄糖含量.此后，酶生物传感器引起了各领域科学家的高度重视和广泛研究，得到了迅速发展.酶生物传感器是将酶作为生物敏感基元，通过各种物理、化学信号转换器捕捉目标物与敏感基元之间的反应所产生的与目标物浓度成比例关系的可测信号，实现对目标物定量测定的分析仪器.与传统分析方法相比，酶生物传感辑是由固定化的生物敏感膜和与之密切结合的换能系统组成，它把固化酶和电化学传感器结合在一起，因而具有独特的优点：(1)它既有不溶性酶体系的优点
3、，又具有电化学电极的高灵敏度;(2)由于酶的专属反应性，使其具有高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定.因此，酶生物传感器在生物传感器领域中占有非常重要的地位. 生物传感器具有多样性、无试剂分析、操作简便、灵敏、快速、价廉、可重复连续使用等特点,已在食品发酵工业、临床医学、环境监测、军事科学等领域展现出十分广阔的应用前景4-9。2酶生物传感器的基本结构酶生物传感器的基本结构单元是由物质识别元件(固定化酶膜)和信号转换器(基体电极)组成.当酶膜上发生酶促反应时，产生的电活性物质由基体电极对其响应.基体电极的作用是使化学信号转变为电信号，从而加以检测，基体电极可采用碳质电极(石噩电板、玻碳电极、
4、碳棚电极)、R电极及相应的修饰电极.3酶生物传感器的分类生物传感器按换能方式可分为电化学生物传感器和光化学生物传感器2种。3.1电化学酶传感器基于电子媒介体的葡萄糖传感器,具有响应速度快、灵敏度高、稳定性好、寿命长、抗干扰性能好等优点,尤为受到重视。二茂铁由于有不溶于水、氧化还原可逆性好、电子传递速率高等优点,得到了广泛的研究和应用。目前研究的重点是防止二茂铁等电子媒介体的流失,从而提高生物传感器的稳定性和寿命。提高传感器稳定性的主要方法是利用环糊精作为载体,形成主客体结构。如孙康等10以-环糊精与戊二醛缩合而成的聚合物(-CDP)为主体,电子媒介体二茂铁为客体,形成稳定的包络物,制成了葡萄糖
5、、乳糖生物传感器。再如朱邦尚等10以电子媒介体1,1-二甲基二茂铁为客体与-CDP形成稳定的主客体包络物。利用二茂铁也可以制成组织传感器。如马全红等12以二茂铁为电子媒介体,将含有丰富酪氨酸酶的蘑菇组织肉浆固定在二茂铁(PVC膜)修饰石墨电极上制成酶电极。其对L-酪氨酸的线性响应范围为2.010-44.510-3mol/L,响应时间小于5 min,电极寿命至少30 d,可用于实际样品分析。提高传感器稳定性的另一种方法是在电极表面覆盖一层Nafion膜。如贾能勤等13以基于丝网印刷技术制作的碳糊电极为基底电极,用二茂铁为电子媒介体,Nafion修饰厚膜碳糊电极制成了葡萄糖传感器。Nafion膜既
6、可以防止二茂铁的流失,又可以防止抗坏血酸、尿酸的干扰,具有防污能力。该传感器的检测上限可达18 mmol/L,响应时间小于60s。二茂铁及其衍生物对抗坏血酸具有催化作用,易受抗坏血酸的干扰。而N-甲基吩嗪则可以消除抗坏血酸等的干扰。李海虹等14通过交联方式将辣根过氧化物酶(HRP)固定在Eastman-AQN-甲基吩嗪修饰电极上,制成过氧化氢生物传感器。将它与GOD和半乳糖苷酶结合,制成双酶和三酶体系的生物传感器,用于葡萄糖和乳糖的测定。王朝瑾15利用N-甲基吩嗪作为媒介体,通过牛血清白蛋白和戊二醛使其结合到玻碳电极上制成了HRP生物传感器。该酶电极对H2O2有良好的响应,对H2O2的线性范围
7、为110-6510-4mol/L,检出限为10-7mol/L,响应时间小于10 s。锇配合物也是一种有效的电子媒介体。龚毅等16研究了锇-聚乙烯吲哚Os(bpy)2(PVI)10ClCl配位聚合物和Nafion双层膜修饰玻碳电极的电化学特性,该膜对肾上腺素的电化学氧化有催化作用,对肾上腺素的线性范围为1.010-68.610-5mol/L,相关系数为0.9987。此外,常用的媒介体还有苯醌、对苯二酚和甲苯胺兰等。3.2光化学酶传感器宋正华等将具有分子识别功能的-葡萄糖甙酶和能进行换能反应的Luminol分别固定在壳质胺和大孔阴离子交换剂的柱中,组成流动注射系统。苦杏仁甙在-葡萄糖甙酶催化下分解
8、生成的CN-(分子识别反应)与溶解氧反应生成超氧阴离子自由基,继而同Luminol反应产生化学反应(换能反应)。这一新型生物传感器的化学发光强度与苦杏仁甙量在1200g之间呈良好线性关系,检出限为0.3g,相对标准偏差为3.1%,并具有良好选择性。李瑛等首次以碳糊为固定化载体,将GOD固定在碳糊电极上,制成了光导纤维电化学发光葡萄糖生物传感器。葡萄糖的酶催化反应、鲁米诺的电化学氧化和化学发光反应可以在电极表面同时发生。该传感器制作简单,响应时间仅为10 s,线性范围宽,葡萄糖浓度在1.010-52.010-2mol/L范围内与发光强度呈线性关系,检出限为6.410-6mol/L,可应用于市售饮
9、料中葡萄糖的测定。4酶生物传感器的工作原理 当酶电极漫入被测溶液，待测底物进入酶层的内部并参与反应，大部分酶反应都会产生或消耗一种可植电极测定的物质，当反应达到稳态时，电话性物质的浓度可以通过电位或电流模式进行测定.因此，酶生物传.器可分为电位型和电流型两类传感器.电位型传感辑是指酶电极与参比电极间输出的电位信号，它与被测物质之间服从能斯特关系.而电流型传感器是以酶促反应所引起的物质量的变化转变成电流信号输出，输出电流大小直接与底物浓度有关.电流型传.器与电位型传感器相比较具有更简单、直观的效果.5酶生物传感器的发展5.1第一代酶生物传感器第一代酶生物传感器是以氧为中继体的电催化。缺点是：(1
10、)响应信号与氧分压或溶解氧关系较大，溶解氧的变化可能引起电极响应的波动；(2)由于氧的糟解度有限，当溶解氧贫乏时，难以对高含量底物进行测定；(3)当由酶促反应产生的过氧化氢以足够高的浓度存在时，可能会使很多酶去活化；(4)需采用较正的电位，抗坏血酸和尿酸等电活性物质也会披氧化，产生干扰信号.5.2第二代酶生物传感器为了改进第一代酶生物传感器的缺点，现在普遍采用的是第二代酶生物传感器。第二代生物传感器采用了含有电子媒介体的化学修饰层.此化学修饰层不仅能促进电子传递过程，使得响应的线性范围拓宽，电极的工作电位降低，同时，噪声、背景电流及干扰信号均小，且由于排除了过氧化氢，使得酶生物传感器的工作寿命
11、延长.电子媒介体在近十年以来得到迅速发展，使用的媒介体种类也越不越多。5.3第三代酶生物传感器 第三代酶生物传感器是酶与电极间进行直接电子传递，是生物传感器构造中的理想手段.这种传感器与氧或其它电子受体无关，无需媒介体，即所谓无媒介体传感器，但由于酶分子的电话性中心深埋在分子的内部，且在电极表面吸附后易发生变形，使得酶与电极间难以进行直接电子转移，因此采用这种方法制作生物传感器有一定难度.到目前为止，只发现过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、醋氨酸酶、细胞色素C过氧化物酶、超氧化物歧化酶、黄嘿岭氧化酶、微过氧化物酶等少数物质能在合适的电板上进行直接电催化.6酶传感器中应用的新技术6.1纳米技术固定化酶时
12、引入纳米颗粒能够增加酶的催化活性,提高电极的响应电流值。首先,纳米颗粒增强GOD在载体表面上的固定作用;其次是定向作用,分子在定向之后,其功能会有所改善;第三,由于金、铂纳米颗粒具有良好的导电性和宏观隧道效应,可以作为固定化酶之间、固定化酶与电极之间有效的电子媒介体,从而使得GOD的氧化还原中心与铂电极间通过金属颗粒进行电子转移成为可能,酶与电极间可以近似看作是一种导线来联系的。这样就有效地提高了传感器的电流响应灵敏度。孟宪伟等17首次研究了二氧化硅和金或铂组成的复合纳米颗粒对葡萄糖生物传感器电流响应的影响,其效果明显优于这3种纳米颗粒单独使用时对葡萄糖生物传感器的增强作用。其原因是纳米粒子具
13、有吸附浓缩效应、吸附定向和量子尺寸颗粒效应,复合纳米颗粒比单独一种纳米颗粒更易于形成连续势场,降低电子在电极和固定化酶间的迁移阻力,提高电子迁移率,有效地加速了酶的再生过程,因此复合纳米颗粒可以显著增强传感器的电流响应6.2基因重组技术周亚凤等18将黑曲霉GOD基因重组进大肠杆菌、酵母穿梭质粒,转化甲基营养酵母,构建出GOD。GOD力达426.63 u/mg蛋白,是商品黑曲霉GOD的1.6倍,催化效率更高。重组酵母GOD的高活力特性可有效提高葡萄糖传感器的线性检测范围。6.3溶胶-凝胶技术溶胶-凝胶应用于生物传感器领域具有如下一些优点19:(1)基质在可见光区是透明的,适于光化学生物传感器的制
14、作;(2)基质具有一定的刚性,提高了生物活性物质的热稳定性;(3)基质热稳定性好,并且呈化学惰性,对生物活性物质的失活作用很小,保持了活性;(4)通过溶胶-凝胶制备条件的优化,可控制基质的孔径大小和分布,使酶分子有足够的自由活动空间而又不至于从基质中流失,从而提高传感器的使用寿命;(5)溶胶-凝胶材料还具有生物相容性,为微电极植入人体提供了新的可能性;(6)还可通过对先驱体的功能化赋予溶胶-凝胶新的性能;(7)溶胶-凝胶的制备条件十分温和,生物分子可以在不同的制备阶段加入,并且可以制成不同大小与形状的修饰电极等。溶胶-凝胶材料作为酶固定化载体,开辟了制备生物传感器的新领域。以溶胶-凝胶技术固定
15、生物活性物质的生物传感器的基本构型有电极型生物传感器和导波传感器等。有关溶胶-凝胶法制作生物传感器的文章多见报道,但大多处于实验室阶段。5.4提高传感器综合性能的其他技术提高固定化酶活力的根本方法是保持酶的空间构象不发生改变。如唐芳琼等考察了磺基琥珀酸双2-乙基己基酯钠盐(AOT)反胶束包埋酶对GOD构象和化活性的影响。结果发现随GOD/AOT比值的减小,响应电流大大增加,这意味着大大增加了酶的催化活性和酶构象的稳定性。原因是表面活性剂可以保护酶的构象不被破坏,进而保护酶的催化活性,使酶电极的电流响应具有稳定性和宽的响应范围。改变“手臂”分子长度是获得固定化酶高活力的主要方法。如周祖新通过更换
16、烷基化试剂,即用三乙基氧嗡四氟化硼代替硫酸二甲酯,使固定化过氧化氢酶膜的性能有很大改善。原因是前者的“手臂”分子长,与其他欲连接的基团接触容易,最后使单位面积上固定化酶的数目增加,性能良好。制备多电子媒介体和联酶的生物传感器也是提高生物传感器综合性能的重要方法。如郭鼎力等31研制了以四氰二甲苯醌等和四甲联苯胺等为介体的双介体多酶生物催化-氧化还原体系构成的电流型生物传感系统,具有灵敏度高、准确性好、取样少、测量迅速的夹心式生物传感器。该传感器对正常到高度异常的血糖含量,测量相对误差是3.9%7.5%,相关系数为0.9881;而对胆固醇的测量相对误差和相关系数分别为5.8%7.6%和0.9549。7结束语酶生物传感器自产生以后得到了迅速发展20,实现酶氧化还原活性中心与电极之间
