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1、基因工程技术操作1. 为什么要学习基因工程技术操作？1） 只有在实验室才能真正学会和掌握基因工程的重要概念和相关原理。2） 只有在实验室才能真正增长知识和才干。3） 只有亲手做过的实验才能记忆犹新。2. 珍惜实验课的体会：1)基因工程实验的开设来之不易。2)实验课上的学习内容将为你今后的科学生涯打下宝贵的基础。3. 实验室常见的仪器设备及用途：1)纯水仪：用途：制纯水 注意事项：防止爆炸，防止发水。2)天平：托盘天平（配平实用） 电子天平（0.01、0.001、0.0001）3)磁力搅拌器（具有加热功能） 4）酸度计用途：配置药品 调PH值注意事项：防止腐蚀 保护电极4)高压灭菌锅（手动、半自
2、动、全自动）用途：灭菌。注意事项：使用前检查锅内水是否充足 使用前设定好灭菌的温度、压力和时间打开和关闭灭菌锅是注意同时旋转对称的螺旋至少待灭菌无稍微冷却后方可去除5)超低温冰箱（-80。C） 7）普通冰箱（-20。C）用途：用于贮藏药品、材料等。注意事项：确保冰箱门关严 防止冻伤6)超净工作台： 用途：用于植物组织培养、微生物接种。 注意事项：确保使用状态时紫外灯必须关闭 保持清洁 不要用酒精擦拭有机玻璃挡板7)恒温培养箱： 用途：用于液体培养基中对细菌的培养 注意事项：使用前调好温度计转速8)高速冷冻离心机（台式、立式） 用途：用于DNA、RNA等提取过程中的高速冷冻离心 注意事项：使用前
3、要预冷，调好温度转速等 必须调平 使用后要关电源，擦拭干净（离心机内部的水珠）9)PCR仪： 用途：用于基因扩增 注意事项：使用前设好程序 使用后关闭电源10)移液器：（0.21000l） 用途：用于微量液体的移取 注意事项：使用前必须看清楚量程，并在量程范围内使用。 使用时要缓慢用力 切记避免有机溶剂腐蚀枪杆 使用后调至最大量程11)微波炉： 用途：融化琼脂糖凝胶，或琼脂粉 注意事项：注意微波时间 避免污染物污染12)凝胶电泳装置： 用途：用于核的电泳的检测 注意事项：使用前要注意电泳的方向与电泳槽的正负极是否吻合，设定拟使用的电压，电流等。 使用时要戴PE手套，并注意不要产生大量的污染物。
4、13)UV投射仪及凝胶成像系统： 用途：用于核算条带的观察及照相 注意事项：不要造成EB污染 使用时要先开电源，再开紫外，关闭是相反。 使用后将凝胶几时拿走放回收处，并使仪器内部保持清洁。14)烘箱： 用途：用于烘干器皿 注意事项：防止器皿水分过多，造成短路。 塑料凳器皿切记不要高温烘烤 玻璃器皿等高温烘烤后，注意及时断电，千万不能过夜。15)分子杂交炉： 用途：用于Southern、Northern等分子杂交。 注意事项：正确设定杂交温度，时间等。 防止同位素遗漏，污染。16)恒温培养箱、培养室： 用途：生物材料的培养 注意事项：正确设定培养温度、湿度、光照时间等培养条件。 防止培养箱，培养
5、是污染。 注意温度的调节。17)制冰机： 用途：制碎冰。 注意事项：使用时先接通水源。 使用后要关闭水源。18)蛋白质、核算分析仪： 用途：测定核算及菌液的浓度。 注意事项：使用时要先预热。 使用前要调零。 要调好光源。19)测序仪： 用途：对核算进行测序。 注意事项：防止污染、按程序操作。20)基因枪： 用途：用于转基因。 注意事项：无菌操作，保持清洁。 使用时检查是否漏气。21)其他：恒温水浴锅、研钵研杵、液氮罐、电炉子、通风橱、涡旋器、同位素室及暗室。4. 常见的有害化学物质：A 苯酚、氯仿、异戊醇。B 溴化乙锭（EB）。C 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）。D 焦乙酸二乙脂（DEPC）
6、.E 放射性元素32P、35S5. 安全规程：1)熟悉所有有害物质的标识。2)在不知道正确操作程序时不要使用实验室的药品及仪器。3)不要认为扩大污染源，或随意丢弃污染垃圾。4)如果不小心将有害物质弄到皮肤或衣服上，马上采取有效措施处理。5)严禁在实验室吸烟、饮食、以免误事和吸入有害物质。6)不要穿拖鞋进实验室。实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备一：实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的方法和技术。二：实验原理：感受态细胞是经物理化学方法增强获取DNA能力的细菌细胞，其 原理是处于0。C的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀呈球形，此 时，细菌处于容易吸收外源DNA的状态。三：实验仪器及药品：1.仪器：
7、制冰机、恒温摇床、天平、酸度计2.材料：大肠杆菌DH5，10ml离心管，1.5ml离心管3.试剂：0.1mol/lCaCl2溶液，80%甘油，LB液体培养基（1L），pH7.0-7.3 胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g。四：实验内容：1.用划线法将大肠杆菌DH5接种于无抗性固体培养基上，与37。C倒置培 养1-2天。2. 从菌落上挑取一个单菌落接至3ml液体培养基中，37。C振荡培养过夜。3. 取0.5ml菌液转到一个装有50mlLB液体培养基的锥形瓶中，37。C振荡培 养2-3h4.将菌液转移至10ml离心管中，冰上放置10min。5.4。C离心10min（4000r/min）
8、回收细胞。6. 倒出上清液，将管倒置1min，以便培养液洗尽。7. 用冰冷的2ml0.1mol/lCaCl2溶液悬浮细胞沉淀，立即放在冰上保温30min.8. 4。C离心10min（4000r/min）回收细胞。（其上清）9. 用冰冷的0.1mol/lCaCl20.4ml悬浮细胞（务必放在冰上）10. 分装细胞：200l/份，加30l无菌甘油，混匀置-80。C冰箱中保存， 此细胞即为感受态细胞。思考题：1.感受态细胞制备过程中的注意事项？ 整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪 头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意 防止被其它试剂、DNA酶或杂DN
9、A所污染，否则均会影响转化效率或 杂DNA的转入。整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞 转化率将会降低。 2.Ca2+感受态细胞中的作用？ 促进大肠杆菌转化。实验二 质粒DNA转化大肠杆菌实验目的：掌握质粒DNA转化大肠杆菌的方法技术。实验原理：转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程，其原 理是细菌处于0。CCaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀呈球形，转化混 合物的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物贴附于表面，经42。C 短时间热击，促进细胞吸收DNA复合物，将细菌放置在培养基中保温 一段时间，促使在转化过程中获得新表型得到表达，然后将细菌培养 物涂在含有Amp
10、的选择培养基中。实验仪器：超净工作台、恒温摇床、制冰机、恒温箱、-70。C冰箱、水浴锅实验材料：大肠杆菌DH5，PUC1g质粒，离心管实验试剂：LB固体培养基20mg/ml X-gal40l 200mg/mlPTG40l实验内容：1.取200l新配的感受态细胞加入DNA 2l混匀，冰浴30min，同 时用PUC1g做两个对照： 受体对照：200l感受态细胞+2l无菌水 质粒对照：200l感受态细胞0.1MCaCl2溶液+2l质粒DNA 2.将管放在42。C冰浴中90s。 3.冰浴2min。 4.每管加800l液体培养基，培养45min 5.加4lIPTG和40lX-gal混匀。 6.将混合液移
11、至含有Amp（50mg/ml）的培养皿中，再用无菌涂布棒 将菌液均匀涂满平板。 7.将适当体积（100l）转化的感受态细胞涂在备好的培养基上。 8.倒置平皿37。C培养12-16h，出现菌落。实验结果：含抗生素不含抗生素结果分析受体对照组DNA对照组转化实验组转化数：=菌落数*稀释倍数*转化反应原液体积/涂菌板体积思考题：如何提高转化率？ 1）载体DNA及重组DNA 2)受体细胞 3）转化操作 4）试剂纯度与器皿的洁净度 实验三大肠杆菌质粒DNA的提取实验目的：通过本实验学习和掌握碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA。实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA在拓扑学上的差异来 分离它们
12、，在pH值介于12.0-12.5这个窄小的范围，线性的DNA双 螺旋结构解开而被断裂，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的 氢键会被断裂，但现在两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密的结合在 一起，当加入pH4.8的乙酸甲高盐缓冲液回复pH至中性时，共价闭合 环状的质粒DNA两条互补链仍保持在一起，因此，复兴迅速而准确， 而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会迅速 而准确，它们缠绕成网状结构，通过离心，是染色体DNA与不稳定的 大分子RNA，Pr-SDS复合物等一起沉淀下来被除去。仪器材料与试剂：（一） ：仪器：恒温摇床等。（二） ：材料：葡萄糖，Tris、EDTA、SDS 等（三） ：试剂：1.溶液I：50mmol/l葡萄糖、25mmol/l三羟基氨基甲烷TrisHCL 10mmol/l乙二胺四乙酸EDTA （去除细胞壁，保护DNA ） 2.溶液II:0.4mol/lNaOH(10ml) 2%SDS(10ml)用前等体积混合 (破坏细胞膜，使DNA变性)
