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1、ENNE2017年度申报专业技术职务任职资格评审答辩论文题 目：液相色谱-质谱联用法测定血浆中氯毗格雷浓度及其人体药动学研究作者姓名：周文佳单位：核工业总医院申报职称：副主任药师专业：临床药理二。一七年七月二十六日III液相色谱-质谱联用法测定血浆中氯毗格雷浓度及其人体药动学研究周文佳（核工业总医院药物临床试验机构江苏苏州）摘要：目的：建立液相色谱-质谱联用（HPLC-MS/MS）法测定人血浆中氯毗格雷的血药浓度，研究 健康受试者空腹及高脂高热量饮食情况下口服硫酸氢氯毗格雷片的药动学特征，考察高脂高热量饮 食对硫酸氢氯毗格雷片药动学的影响。方法：采用随机、开放、双周期交叉试验设计。60名男性
2、健康志愿者在两个试验周期分别空腹或餐后口服硫酸氢氯毗格雷片75 mg。采用液相色谱质谱联用 法测定人血浆中氯毗格雷的浓度。用DAS3.2.3药动学软件计算药动学参数，并用SPSS17.0软件对 主要参数进行统计分析。结果：空腹与进食后的主要药动学参数如下：Cmax分别为（1440 土 2397） ngL-i和（4155 土 2117）ngL-1, AUC0-36 h分别为（2268 土 3887）ngL-1 h 和（8691 土 3628） ngL-1 h, AUC0-8分别为（2324 土 3899）ngL-1 h 和（8816 土 3668）ngL-1 h, t1/2分别为 （5.7 土
3、4.7） h 和（8.8 土 3.8） h,匚成分别为（0. 7 土 0.5） h 和（1.7 土 0.7） h,匕分别 为（520115 土 471187） L 和（118826 土 59077） L, Cl 分别为（82365 土 70072）Lh-1 和（9949 土 4017）Lh-1, MRT0-36 h分别为（3.0 土 1.8） h和（3.6 土 0.9） h。经检验，空腹与进食后的 主要药动学参数均有显著性差异（P0.05）。结论：高脂高热量饮食对硫酸氢氯毗格雷片的药动学 特征有显著影响，餐后给药可使氯毗格雷的达峰时间延长，生物利用度提高，半衰期延长。关键字：氯毗格雷；药动学；
4、液质联用；食品药物相互作用；高脂高热量饮食Determination of clopidogrel in human plasma by HPLC-MS/MS:application to pharmacokinetics studyZhou Wenjia(The General Hospital of Nuclear Industry, Drug Clinical Trial Institution, Suzhou,Jiangsu)Abstract： Objective: To establish an high performance liquid chromatography-tande
5、m mass spectrometric method (HPLC-MS/MS) for the determination of clopidogrel in human plasma, to study the effects of high fat and calories diet on pharmacokinetics of clopidogrel hydrogen sulphate tablet in Chinese healthy volunteers by comparing pharmacokinetic parameters under fasting and fed co
6、nditions. Methods： 60 healthy male volunteers were assigned to receive single oral dose of clopidogrel hydrogen sulphate tablet 75 mg on emptystomach or in combination with high fat and calories diet in two weekends by a randomized sequence, open-label, two-period crossover design. Plasma concentrat
7、ions of clopidogrel were measured by HPLC-MS/MS. The pharmacokinetic parameters were calculated by DAS3.2.3, and the effect of the high fat and calories diet on the pharmacokinetics of clopidogrel was evaluated by SPSS17.0.Results: Under fasting and fed conditions, the mainpharmacokinetic parameters
8、 of clopidogrel were as follows: C were (1440 土 2397), (4155 土 2117) ngL-1, AUC0 36 h were (2268 土 3887), (8691 土 3628) ngL-1 h, AUC0 were (2324 土 3899), (8816 土 3668) ngL-1 h, t1/2 were (5.7 土 4.7), (8.8 土 3.8) h,匕嵌 were (0.7 土 0.5), (1.7 土 0.7) h, Vd were (520115 土 471187), (118826 土 59077) L, Cl
9、were (82365 土 70072), (9949 土 4017) Lh-1, MRT0-36 h were (3.0 土 1.8), (3.6 土 0.9) h. The results of statistical analysis showed that there were significant differences on all main pharmacokinetic parameters (P0.05) between fasting and fed group. Conclusion: It is suggested that high fat and calories
10、 diet has effect on pharmacokinetics of clopidogrel hydrogen sulphate tablet, with bioavailability as well as t and t1/2 increased.Keywords: clopidogrel; pharmacokinetics; HPLC-MS/MS; food-drug interactions; high fat and calories diet1. 引言氯吡格雷(Clopidogrel )是噻吩并吡啶类药物，主要通过阻断ADP受 体而抑制血小板活性，具有不可逆抑制血小板聚集
11、的作用，目前在临床上 广泛用于心肌梗死、脑卒中和周围动脉缺血等动脉血栓性疾病的治疗1。氯 吡格雷是一种前体药物，在体内，氯吡格雷原型药物约85%通过酯酶水解 为无活性的氯吡格雷酸，另有大约15%氯吡格雷通过CYP3A4、CYP3A5、CYP2C19等酶代谢为2-氧-氯吡格雷，然后通过酯酶水解成具有生理学活性 的氯吡格雷硫醇衍生物2临床上氯吡格雷疗效的个体差异广泛存在，部分患者在接受氯吡格雷 常规治疗时，仍达不到预期的抗血小板治疗作用，甚至导致严重心脑血管 事件及死亡，即“氯吡格雷抵抗”3,4。由于氯吡格雷药代动力学及药效学与CYP2C19有着显著联系，目前临床已采取在用药前，先对患者进行氯吡格
12、 雷CYP2C19基因检测，再针对携带缺陷基因的患者实施个体化用药。但 造成氯吡格雷临床疗效差异的原因除了基因多态性外，还包括药物相互作 用、临床因素、患者依从性等因素5。因此，对氯吡格雷进行血药浓度监测 可以直观的反应各种情况服药后氯吡格雷体内暴露量，为医生实施个体化 治疗提供更直观的理论依据，这对基因检测手段是一个补充。相对于基因 检测耗时长、费用高，采用HPLC-MS/MS法测定氯吡格雷血药浓度的监测 手段具有灵敏、快速、简便、易推广的特点。目前，已有文献6-14 通过测定氯吡格雷或氯吡格雷酸的血药浓度评价 试验药物的等效性或药动学特征，但最近欧洲药品评估局(EMEA)指出进行 氯吡格雷
13、的等效性研究时，只需评价原型药物氯吡格雷的血药浓度水平15， 且部分文献的测定方法存在基质效应、代谢物回转的问题，会影响测定准 确性。因此，本文建立了灵敏、准确、快速的HPLC-MS/MS方法用于测定 氯吡格雷血药浓度，以考察血浆样品中氯吡格雷的药代动力学特征。硫酸 氢氯吡格雷片为口服制剂，因而饮食易对氯吡格雷吸收和分布产生影响， 在中国人群中，饮食对氯吡格雷吸收影响的研究尚未见报道，因此，研究 高脂高热量饮食对硫酸氢氯吡格雷片药动学的影响对国内临床用药方案制 订具有重要的临床意义。2. 材料2.1仪器API-4000型三重四极杆串联质谱仪，配备电喷雾离子源(ESI)以及Analyst 1.4
14、.2 数据处理软件（美国 Applied Biosystem Sciex公司）；Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司，包括四元泵、自动进样器、柱 温箱、在线脱气）；XS 105DU型分析天平（瑞士 METTLER TOLEDO公 司）；Heraeus Biofuge Stratos高速低温离心机（美国Thermo公司）； Vortex Genie-2 涡旋混合器（美国 Scientific Industries 公司）；Milli-Q 纯 水机（美国MILLIPORE公司）；MDF-U32V（N）低温冰箱（日本SANYO 公司）；移液器（德国Eppendorf公司）。
15、2.2药品与试剂硫酸氢氯吡格雷对照品（批号100819-201102，含量99.5%）购自中 国食品药品检定研究院，内标硫酸氢氯吡格雷-d4对照品（批号 6-AAH-193-1，含量 98%）购自 Toronto Research Chemicals Inc。硫酸 氢氯吡格雷片（波立维，规格75 mg-片-1，批号1A024 ）由Sanofi Winthrop Industrie生产，赛诺菲安万特（杭州）制药有限公司分装。乙腊，色谱纯， 购自TEDIA COMPANY , INC公司；甲酸，色谱纯，购自Aladdin ；灭菌 注射用水，购自石家庄四药有限公司。空白血浆来自健康受试者。3. 方法
16、3.1试验设计选择男性健康受试者60名，年龄为（22 3 ）岁，体重为（64.0 6.9 ） kg，身高为（1.71 0.06 ） m，体重指数为（21.8 1.5 ） kg-m-2 ,受试 者在受试前2周和试验期间没有服用任何药物，均无烟酒嗜好。试验前进 行病史询问和体格检查，血压、血糖，心、肾、肝功能，尿、血常规检查 均正常。本试验方案经苏州大学附属第二医院伦理委员会批准。受试者了 解试验目的、意义及可能发生的不良反应后签署知情同意书。60名健康受试者随机分成2组，采用随机、开放、双周期交叉试验设 计，清洗期为1周。给药前一天受试者禁食过夜10 h后，试验当天早晨一 组受试者空腹口服波立维 ( 75 mg-片-1 ) 1片，另一组受试者进食高脂高 热量试验餐，进食在30 min内完毕，从进食第一口起计时，30 min后
