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1、用于蛋白质偶联的亲水性聚合物载体United States Patent 4511,694Kramer, et al April 16, 1985 Hydrophilic Polymer Carrier for Proteins 权利要求书1 本专利申请的是一种制备一种用于蛋白质连接的珍珠状交联亲水性聚合物载体的方法。这种方法包括反向珍珠聚合（靠自由基聚合机理），单体相以小滴形状分散在非水有机介质中，单体相包含下列单体的混合物：（1） 重量含量30-95%的可聚合的单体，至少一种化合物来自于下列化合物群：丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺，甲基-双丙烯酰胺，和亚甲基-双-甲基丙烯酰胺。（2） 0-65%的
2、亲水性自由基可进一步聚合的共聚体（3） 5-60%的至少一种不饱和可自由基聚合的单聚体含有环氧基团，并且（4） 0-25%的至少一种其他可自由基聚合的共聚单体，有轻微的亲水性，这种可聚合单体至少5%的含有至少两个可聚合双键，进一步聚合单体相包括稀释剂，这种稀释剂是下列东西的混合物。（A） 至少一种溶剂来自于“水，甲酰胺，乙二醇，和二甲基亚砜，而且（B） 至少一种有机溶液有别于（A），且与前面所说的单体混合物和A一起形成均匀相。这种有机液体的分子重量低于200，至少含有20%的氧（按重量计算，如羟基）。这里所说的稀释剂混合物出现的（A）和（B）的比例是使A+B与前面所述的单体混合物形成均匀相，这
3、样使得前面所说的含有单体混合物的单体相，与稀释剂互不相溶，单体相悬浮在里面，被称为非水有机相。2 如权利要求1中所说的方法，在这种方法中B的溶解性系数在915 Hildebrand 单位。或分解溶解性系数（a dispersive solubility parameter）在79.4 Hildebrand 单位之间。3 如权利要求1中所说的方法，这种方法中B与水在室温下完全互溶。4 如权利要求3中所说的方法，这种方法中，其稀释剂是水和甲醇的混合物。5 如权利要求1中所说的方法，这种方法中，在引发聚合物反应前一种聚合物被溶解在单体相中。6 用权利要求1所述的方法制备的一种亲水性珍珠聚合物。7 如
4、权利要求6所述的能将蛋白质连接其上的亲水性珍珠聚合物。 描述 本发明与制备一种珍珠状的亲水载体聚合物（能够键合蛋白质的）有关，与这一类聚合物和它们的用途有关。 从German Auslegeschrift No.2237316 我们知道如何制备一种珍珠状的交联共聚化合物，这种化合物在水中可溶胀，是用一种单体混合物，一种交联单体和一种亲水性单体进行反相珍珠聚合而成，其中的单体混合物由能够键连蛋白质的单体组成。为了获得好的溶胀性和广的交联网络，溶解单体混合物被溶解在一种与非极性有机聚合介质不能相溶的溶剂中。溶液在这种介质中以小液滴的形式悬浮存在，也以这种形式进行聚合。甲酰胺，二甲基甲酰胺，或二甲基
5、亚砜被用作这种单体混合物的溶剂。 根据German Offenlegungsschrift NO.27 22 751，如果交联单体在单体混合物中所占的比例是5%或更多，丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺或甲基-双丙烯酰胺，或亚甲基-双-甲基丙烯酰胺的重量比例超过某一界限值的话，用这种方法得到的聚合物具有空白的珍珠结构，这被认为对于高键联活性是非常重要的。这种已为人们所知的亲水性珍珠聚合物由包含有环氧基团的单聚体单元（这种环氧基团能够偶联蛋白质），组成，比如缩水甘油基甲丙烯酰胺盐或烯丙基缩水甘油醚。这些单聚体单元水可溶性蛋白质与它们共价偶联，且维持它们的生物活性，尽管以这种方式得到的聚合物与一些酶可达到高的
6、结合能力，然而与其他酶类的结合能力却仍然不尽如人意。“结合能力”被人们理解的是珍珠状聚合物达到最大量吸附负载某种特定酶时这种酶的活性大小。已经证实，靠提前环氧基团在珍珠聚合物表面的含量，或是在键连酶时使用这种酶的高浓度溶液，无法提高或无法从根本上提高某种特定酶的界限。本专利的目的在于提高这种可在环氧基团上共价偶联蛋白的亲水性珍珠聚合物的键合能力。从狭义上讲，本发明的目标在于如何在考虑键合某种蛋白时这种珍珠状载体的键合能力优化。人们现在已发现，用本发明所说的方法可形成一种结合能力提高了的，对某些酶来说甚至是最优化的键合能力的珍珠状载体聚合物。有机介质分子量氧原子含量（重量%）溶 解 性 系 数d
7、eltaDelta sub D甲醇325014.37.4乙醇4635.012.97.7正丙醇6026.711.97.8异丙醇6026.711.5-正丁醇7421.611.37.8丙酮5827.69.87.6乙酰丙酮醇11627.610.27.7甲基乙基酮7222.29.37.8四氢呋喃7222.29.58.2二甲基甲酰胺7322.012.18.5乙烯基醋酸8836.49.17.4乙烯醇9035.58.3-二乙烯醇11827.111.97.9水，甲酰胺，乙二醇，或二甲基亚砜或它们的混合物可被用作稀释剂的A组分。令人惊讶的是，尽管水可与环氧基团很容易反应（这些环氧基团对键合能力是非常重要的），但采
8、用这种聚合方法时，即使是用水作A组分，该载体对蛋白质的键合能力仍维持很高。至于稀释剂的B组分，某些因具有氧原子而具有高极性的有机液体介质被证实的是很适合做（B）。如果这种有机液体的氧含量在20%以上，并且分子量低于200，所要求的极性就足够了。这种有机液体如果是脂肪族有机液体，氧原子的羰基或羟基形式存在更好。另一方面，羰基由于具有与环氧基团高度的反应活性在此方法中又不适应。在酯键连接中发现的氧原子也可提供理想的极性，比如脂肪族，脂环醚和脂肪醚。对本发明的方法合适的组分（B）绝大多数的总溶解性系数（delta）在（9-15）之间，特别是1114.5，Hildebrand 单位，或分散溶解性系数（
9、subD）。在79范围内，最好是在7.48.5 Hilderbrand Units（Cf. Polymer-Handbook Second Edition, 1975, pages IV 337, et Sep., incorporated here in by reference）单体混合物与稀释剂组分(A)和（B）。必须形成均匀相，如果可能的话应选择那些在室温下（20），就已经能形成均匀相的介质，这里不可能列出所有可能的组合。再进一步讲，这种均匀相混合物与所悬浮的有机介质必须不互溶，至少在聚合温度时应该不互溶，这样一种隔离的悬浮单体相形成了。假如稀释剂组分在有机介质中有一定的溶解度，这些组
10、分中的单聚体相可能被消耗光，从而导致键合能力的变化。无论如何为了达到特别的键合能力，这里建议有机介质在聚合前用稀释剂组分（A）或（B）（能在有机介质中可溶的）预先饱和，或调节至相应的平衡浓度。通过这种方法有机介质的极性增强。稀释剂组分往有机介质中加入的量必须维持在某一限之下，在这个极限值，单聚体相会溶解在有机相之中。通过选择足够非极性的有机介质，可避免这种方法的上述极限值。这里要推荐的是脂肪族烃和氯代烃，或它们的混合物。如果组分(A)和（B）完全互溶的话是非常有好处的，因此如果可能的话，使它们在室温下就已经完全互溶。组分（B）的有机液体最好是在室温下就与水完全互溶的一族，如甲醇，乙醇，丙醇，丙
11、酮，二甲基甲酰胺，或四氢呋喃。从技术角度上而言，一个特别有优势的组合是甲醇和水的混合物。组分(A)和（B）互相混合的比例可在很宽的范围内进行选择，重量百分比可在99：11：99之间，其中最好为90：1010：90之间。由组分(A)和（B）组成的稀释剂的数量，在单体相中可在20%90%（重量比），最好在50%90%之间。为了确定这个部分的量和组分(A)与（B）的比例大小，在小试批量生产中一系列不同的珍珠聚合物被相应的制备出来，每种情况下对某种特定蛋白质的键合能力测定出来。这样发现了一个规律，即随着(A)和（B）的比例的变化，键合能力上升直至达到一个最大值，那以后（thereafter）出现下降（
12、如下所示），用于反相聚合的单体包括30份（重量）的甲基丙烯酰胺30份（重量）的N,N-亚甲基双-甲基丙烯酰胺20份（重量）的缩水甘油基醚甲基丙烯酰胺20份（重量）的烯丙基缩水甘油醚73份（重量）的甲醇与丙烯酰胺的混合物所得产物用来在最优条件下偶联青霉素-酰基转移酶（PCA） 稀 释 剂 最大量酶 A B activity甲酰胺 甲醇 (U/g) 10 90 71 30 70 101 50 50 124 90 10 125 100 0 95对于其它酶来说，这个系统的活性最大值时(A)和（B）的比例可能有所不同。为了确保珍珠聚合物的亲水性，在这种制备中使用的单聚体混合物必须绝大多数为亲水性的单聚体
13、。甲酰胺，甲基丙烯酰胺和它们的亚甲基-双-酰胺属于这一类单体，以及这一类的不饱和的自由基可聚合单体，形成时在室温下10%以上形成这种单体，这种情况下最好不要含有离子基团，或加入酸或碱时可离子化的基团。这一类适合的亲水性共聚单体的例子有：不饱和可聚合的碳酸的羟烷基酯，比如羟乙基丙烯酸盐，羟乙基甲基丙烯酰盐，2-羟丙基-丙烯酸盐或2-羟丙基-甲基丙烯酸盐，和N-乙烯基吡咯烷酮（pyrrolidone）。丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺和它们的亚甲基-双-酰胺在其中出现的数量至少占30%，最好在50%以上，延伸亲水性共聚体在可聚合单体中出现的数量可机动调节，最高值为65%。单体中有环氧基团的在单体混合物中出现
14、的数量在560%之间。这些单体可为缩水甘油基丙烯酰胺，缩水甘油基甲基丙烯酰胺，烯丙基缩水甘油醚。如果需要的话，也可同时使用。当珍珠聚合物与蛋白质充分反应后，或与水介质充分接触后，环氧基团逐步完全转化成羟基，这种处理方法使得聚合物的亲水性进一步增加。延伸共聚体的亲水性稍差一些，它会使饱和水溶液中室温下聚合物亲水性下降10%，如果使用的话，其在单体相中重量百分含量小于25%。用本发明制备的珍珠状聚合物是高度交联的。用作交联剂的有效共聚单体，分子中有两个或更多的未饱和乙烯基可供聚合，这种交联剂在单体混合物中至少占5%的组成。一般而言，亚甲基-双-丙烯酰胺或亚甲基-双-甲基丙烯酰胺可用作交联剂。在这种情况下，可聚合单体中，这种交联单体的数量超过90%（重量比）。然而如果其他交联单体用来代替它，或对其进行添加补充的话，这种单体的数量限制，其最多只能占45%。悬浮的单体相包含聚合引发剂，优化延伸剂作为延伸成分，这些都是目前聚合工艺上已知的东西。从本质上而言反相珍珠聚合的方法是已知的。单体相通过搅拌悬浮在有机介质中，那里面最好含有可溶性分散介质，以形成10m到1000m直径的液滴。粒子尺寸的大小通过选择分散剂的种类和数量，搅拌的速率而调节到理想的值。聚合在单体液滴内发生，将液滴转化成固体珍珠聚合物，这些聚合物在聚合结束后可从有机介质
