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1、第一节 鸡胚接种一、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡
2、胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非 SPF 鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用 SPF 鸡胚。一般说来，孵育至 8-14 天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒， 14 天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。在操作鸡胚时
3、）一定要注意到这一点。 孵育至 21 天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。鸡胚的钝头（俗称“大头”），是气室，其功能是呼吸和调节胚内压力。壳膜之下为血管丰富的绒毛尿囊膜，其外层为绒毛膜，系外胚层形成，内层为尿囊膜，系内胚层形成，两膜所夹
4、为中胚层。由于胚胎的肺发育不完善，此时绒毛尿囊膜代行胚胎呼吸器官的作用，气体的交换是在绒毛尿囊膜的血管内通过卵壳进行的。尿囊腔是胚胎的排泄器官，内含的尿囊液初为透明液体，成分极类似于生理盐水溶液，以后则尿酸盐含量增高。尿囊液量在 11-13 日龄时最高，平均达 6 毫升左右。 羊膜是胚胎的最内层包被，系外胚层和中胚层形成，羊膜腔内含羊水，胚胎浸于其中，羊水在起初是单纯的生理盐水溶液，以后蛋白质含量增加。羊水量在 8-15 日龄时最高，平均约为 1 毫升左右。附着于胚胎上的是卵黄囊，其膜系由内胚层和中胚层形成，内包卵黄，是胚胎发育的养料。卵的尖端（俗称“小头”）是卵白，是胚胎发育晚期的养料。 二
5、、鸡胚培养实验用器械不鸡胚培养技术简便，但一些最基本的设备仍需具备，它们包括：孵化箱、检卵器、卵架、打孔器、镊子、酒精灯、无菌眼科镊子和剪刀、吸头、洗耳球、注射器、适用的针头、无菌试营、平皿、三角瓶、烧杯、消毒胶布、石蜡和灭菌生理盐水等。下面就一些最基本的设备作一简单介绍： 孵化箱 是给受精卵提供发育条件的设备，要求恒温恒湿。市售专用孵化箱可自动进行气体交换和翻蛋。实验室中，常用普通恒温培养箱或恒温室代替，要注意保持室内湿度和人工翻蛋。 检卵器 有市售专用检卵器，在暗室中操作。也可根据条件向行设计，用木板制成一大小为 35 25.5 15 厘米的木盒，上半层为一暗室，上方开一小孔，以便于用眼检
6、视鸡胚，两侧开大孔以供双手伸入小暗室转动鸡胚蛋和进行标记。木盒中间有一隔板，其中间部位开一卵形圆孔，木盒下层安装有 100 瓦灯泡，待检胚蛋置于卵形孔上。开灯检查，不必在暗室中进行。 打孔器 可用剪刀代替 . 卵 架 孵育用盛放鸡胚蛋的卵盘有市售专用者，实验操作中所用卵架可用木板制成小方盒，上面开一卵形孔。 三、鸡胚的实验室孵育 选择实验室用鸡卵，最好用白色薄壳鸡蛋，其易于观察胚胎的生活情况。实验用卵一般不宜保存过长时间，通常保存期不应超过 10 天， 5 天以内最好。而且不宜在高温下保存，通常保存于 420 ，以 10 条件下最好。适宜的孵育温度为 3839 ，相对湿度为 4560 ，并注意
7、空气流通。孵育 3 天后每天应翻卵 12 次，以保证气体交换均匀，发育齐全，从而避免半边发育现象的出现。孵后第四天用检卵器对鸡卵进行检视，检出未受精卵和死亡的鸡胚。经四天孵育后，未受精卵不见有鸡胚迹象，仅见模糊的卵黄暗影；受精卵则可见清晰的血管小团，其中有鸡胚迹象，较大的鸡胚可见到胚胎主动运动 ; 濒死或死亡的鸡胚则见到胚胎运动呆滞或不运动，血管昏暗、折断或漂落，这种鸡胚应剔出不用。四、鸡胚的接种1.绒毛尿囊膜接种主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖，这些病毒可在鸡胚绒毛尿囊膜上形成痘斑和病斑。此外其它用于绒毛尿囊腔接种的病毒也可使用，而且收毒量更高，缺点是操作不易成功。选取10-13日龄的鸡
8、胚，照检后，将气室及胚胎位划出，并在胚位附近无大血管处，划一记号，用蛋钻在卵壳上磨一裂缝（或用电烙器在卵壳上烙出一个直径为2-3mm的烤焦圈），小心将蛋壳去掉，注意切勿损伤壳膜；在气室中央也钻一个小口，用针尖挑破壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜，滴加1滴无菌生理盐水于刺破处，用吸耳球紧贴气室中央小口，造成负压，即可见生理盐水下沉，绒毛尿囊膜凹下，和壳膜分开，造成人工气室。滴加0.05-0.1ml接种物于绒毛尿囊膜上，腊封口，封口部位朝上，不要翻动，37培养。2.尿囊腔接种主要用于正粘病毒和副粘病毒，例如禽流感病毒和新城疫病毒的分离和增殖，马脑炎病毒也常用、IBD、IBDV也可。选取9 -11日龄
9、的鸡胚，照检后，将气室及胚胎位划出，在气室边缘上打一小口，避开大血管处，注射器沿小口插入1-1.5cm，注入接种物0.1-0.2ml，腊封口。3.卵黄囊接种主要用于虫媒批膜病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体的分离和增殖。选取6 - 8日龄的鸡胚，照检后，将气室及胚胎位划出；垂直放置在卵座上，在气室中央钻一个小口，注射器沿小口插入3 cm，注入接种物0. 1-0.5ml，腊封口。4.羊膜腔接种主要用于正粘病毒和副粘病毒的分离和增殖，操作技术比较困难。A.开窗法：从气室处去蛋壳开窗，从窗口用小镊子剥开蛋膜，一手用平头镊子夹住羊膜腔向上提，另一手注射0.05-0.1ml接种物于腔内，使蛋直立孵化，此法
10、可靠，但胚胎易受伤而死，而且易污染。B.盲刺法：将鸡胚放在灯光向上照射的蛋座上，使蛋转动使胚胎面向术者。在气室顶部到边缘的一半处打一孔，用40mm长的针头垂直插入，月深30mm以上。如已刺如羊膜腔，能使针头拨动胚即可注入接种物0.1-0.2ml，如针头左右移动时胚胎随着移动，则针头已刺入胚胎，这时应将针头稍提起后再注射，石蜡封口。五.鸡胚材料的收获原则上接种什么部位，收获什么部位。（1）绒毛尿囊膜：用碘酊、酒精消毒接种部位及四周，揭去封闭处的卵壳。用灭菌镊子扩大开口处，轻轻夹起绒毛尿囊膜，用消毒剪刀剪下接种面及周围的膜，置于灭菌生理盐水的平皿中。（2）尿囊腔接种：收获前将鸡胚置4冰箱中6h或过
11、夜将鸡胚冻死而使血液凝固，以免收获时流血。用碘酊、酒精消毒气室部位卵壳，以无菌镊子击破气室端卵壳，沿气室周围剪去卵壳，撕去壳膜和绒毛尿囊膜，用镊子轻轻压住胚胎，以无菌吸管或注射器吸取尿囊液于灭菌试管内。收集的液体应清亮，浑浊则表明有细菌污染；呈血红色，说明血管破裂；黄色液体，可能卵黄囊被刺破。应做无菌检验。（3）羊膜腔：首先收取尿囊液，方法同上。后用注射器插入羊膜腔内收集，约可收到1ml液体，无菌检测。（4）卵黄囊：先首先收取尿囊液和羊膜腔液，后用吸管吸卵黄液。将整个内容物倾入无菌平皿中，剪取卵黄膜保存。第二节 细胞培养常用设备 准备室的设备： 单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压
12、锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品规（放置消毒过的物品）、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4冰箱（放置serum和培养用液）。无菌操作 无菌室的灭菌： 1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3来苏尔或者新洁尔灭或者0.5过
13、氧乙酸擦拭。 2.CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3新洁尔灭擦拭，然后用75酒精擦拭或者0.5过氧乙酸，再用紫外灯照射3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟4.实验后灭菌：用75酒精（3新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。实验人员的无菌准备：1.肥皂洗手。可减少手上的微生物。2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋。但是在洁净工作台上时就无需上述防护。如果你有长头发，则应把它系在脑后。不要说话或少说话。如果感冒，则最好不要做组织培养工作。3.用75酒精棉球擦净双手。无菌操作的演示： 1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用
14、75酒精擦拭瓶子的外表面2.靠近酒精灯火焰操作。3.器皿使用前必须过火灭菌4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。器械的清洗和消毒 一、新的玻璃器皿的洗消： 1.自来水刷洗，除去灰尘。2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，
15、然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。7.高压消毒后烘干二、旧的玻璃器皿的洗消： 1刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。3.烘干、
16、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。4.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）5.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。金属器械洗消： 金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（
