《实验报告硝酸还原酶活性的测定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验报告硝酸还原酶活性的测定（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、首都师范大学生命科学学院实验报告课程名称 植物生理实验实验时间2010331成绩 姓名 唐倪文班级_3 学号1090800032实验题目 硝酸还原酶活性的测定一、实验原理硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，硝酸还原酶作用于NO使之还原为NO。NO-+ NADH + H+ NO2- + NAD+ + H2O产生的NO可以从植物组织渗透到外界溶液中，积累在溶液中。因此，测定反 应液中NO含量的增加即表明酶活性的大小。NO含量的测定-磺胺法NO 2-与磺胺和:-萘胺在酸性条件下生成粉红色化合物，用比色法在520nm下读 取光密度值。二、实验用品1. 材料：完全营养的小麦苗，缺氮培养的小麦苗2. 仪
2、器和用具：722型分光光度计，剪刀，真空泵，电子天平，温箱，烧杯，移液枪，tip 头(两种规格：1000卩I，200卩I )三、实验步骤1. 分别配制反应液于小烧杯中(1) 0.1M 磷酸缓冲液5ml +蒸馏水5ml(2) 0.1M 磷酸缓冲液 5ml + 0.2MKNQ 5ml2. NO2-的获得(1) 称取新鲜叶片0.5g共四份,剪成小片，分别置于小烧杯内的反应液中。(2) 在真空干燥器中抽气20min,使叶片沉于溶液底部，溶液即可渗入组织内取代其 中的空气，内部产生的NO可渗透到外部溶液中。3. 将小烧杯转到30 T温箱，使其不见光，保温20min。4. 用5卩g/ml NaNO2母液配
3、制标准梯度溶液 5、4、3、2、1、0.5、0.1、 0 卩 g/ml。5. 吸取不同浓度的NaNOml于试管中，加入磺胺试剂2ml及a -萘胺试剂2ml，混合均匀，在60C水浴中保温20min,于比色杯中，在520nm下进行比色，读取光 密度，然后做出光密度一浓度曲线，以光密度为纵坐标，NaN染度为横坐标。具体步骤及结果如下表和下图所示。试剂管号12345678NaNO母液(ml)00.020.10.20.40.60.81.0蒸馏水（ml）10.980.90.80.60.40.201%磺胺(ml)22222:220.2 % a -萘胺 (ml)22222222每管亚硝酸氮含量（卩g）00.1
4、0.51.02.03.04.05.0每管NaNO浓度（卩 g/ml）00.10.51.02.03.04.05.0光密度00.0150.0520.1040.2020.3020.3960.493标准曲线:光密度值-亚硝酸钠诙度光密度值线性（光密度值）y = 0. 0994 xR2 二 O 99965.吸取反应液各1 ml于试管中加入磺胺和:-萘胺各2 ml,60 C水浴20min,生成 粉红色化合物.用比色法在520nm下读取光密度值，从标准曲线上查得NO的含量, 结果如下表。小麦幼苗兀全培养液缺N培养液KNOKNO小麦鲜重（g）0.510.510.490.48光密度0.1780.1760.065
5、0.039亚硝酸钠浓度（卩 g/ml）1.7911.7710.6540.392亚硝态氮含量（卩g）1.7911.7710.6540.392酶活性105.39104.1840.0424.506. 计算酶活性,以每小时每克鲜重所产生的 NO微克数表示(NQ-/h.g )X (pg)X V1 (ml) V2 (ml)样品中酶活性=(NQyg Fwg-1时)样品鲜重 x酶反应时间(h)公式中：X从标准曲线查出反应液中亚硝态氮总量(gg )VI提取酶时加入的缓冲液体积(ml)2酶反应时加入的酶液体积(ml)完全培养液，KNQ酶活性=(1.791/1)*10/0.51*(20/60)= 105.39完全培
6、养液，H20酶活性=(1.771/1)*10/0.51*(20/60)= 104.18缺N培养液，KNO酶活性=(0.654/1)*10/0.49*(20/60)= 40.04缺N培养液，H2O酶活性=(0.392/1)*10/0.48*(20/60)= 24.50将结果填入上表。四、实验结果分析 在完全培养液和缺N培养液中，加KNO普遍都要比加H20的酶活性高，说明KNO 为酶促反应提供了底物，让酶促反应进行彻底。在完全培养液和缺N培养液中，加KNO相互比较，加H0的相互比较，完全培养 液的酶活性都要高，说明N诱导了硝酸还原酶，使之活性增大。五、思考题1. 依据原理，测硝酸还原酶活性的实质是
7、以什么物质的含量来表示的？哪一步影 响 NO2- 的浸出量？答：实质是以亚硝酸根（NO-）的含量来表示的。因为 NO可以从组织内渗到外 界溶液中并积累，因此测定反应溶液中 NQ的含量的增加，即表明酶活性的大小。真空泵抽气影响NO的浸出量。因为反复抽气放气，溶液可渗入叶组织取代 叶片空气，叶片便沉于溶液底部，酶促反应可以相对完全的进行。2.为什么做两组溶液，一组培养液中加入H0和一组培养液中加入KNO的作用是? 答：培养时做完全培养和缺 N培养是因为硝酸还原酶是诱导酶。实验时一组加KNO一组加HH0是因为KNO为酶促反应提供底物，让反应得 以彻底进行。3. 实验前要使材料经一定时间光照，其作用是? 答：让材料进行一段时间光合作用，积累有机物4. 小烧杯置于30C，不见光保温的原因是？答：酶促反应在暗反应下进行，以防光照下叶绿体形成还原型铁氧还蛋白，促使 亚硝酸镁把NO还原成NH。暗反应下反应可阻止 NO-的继续反应。5. 第一次30min和第二次20min的作用是？答阻止NQ的继续反应让NO和磺胺，a-萘胺反应充分，显色完全。显色反应的速度与重氮化作用 及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色，同时也影响灵敏度。
