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1、人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析实验方案一、实验背景（具体背景请组员自己查，以下仅供参考）人类染色体组型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体在技术的基础上按照染色体的大小和形态特征，主要根据着丝点位置对染色体进行分组、排队和配对。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。通过对人类染色体组型进行分析可以初步学会对染色体进行分析的方法。二、实验目的掌握人体外周血淋巴细胞培养方法与人类染色体组型分析的方法三、实验原理（理论基础，供参考）1.细胞培养是在体外模拟体内的生理环境培养从机体中取出的细胞并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。要使
2、细胞能在体外长期生长必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度、注意外环境酸碱度和渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。2.染色体是组成细胞核的基本物质,是基因的载体。人类细胞遗传学研究的主要对象是染色体。本实验采用了微量全血培养技术，既方便又节省人力物力。在正常情况下,人外周血中是没有分裂相的,只有在异常情况下才能发现。 植物血细胞凝集素(PHA)是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂,在PHA作用下,原处于G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞,进而进行有丝分裂。利用PHA这一特性, 淋巴细胞经过含有PHA培养液培养,
3、在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体,终止分裂中期的淋巴细胞,经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定就可获得大量的中期有丝分裂细胞。最后经空气干燥法制片，便可得到质量较好的染色体标本，即可得到所需的人体染色体图形。3.染色体组型又称核型,是指将动物、植物、真菌等的某一个体或某一分类群亚种、种、属等的体细胞内的整套染色体按它们相对恒定的特征排列起来的图像。核型模式图是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起来的图像。染色体组型分析就是通过对染色体标本和其照片进行测量、对比分析、配对、分组、排列对各染色体的形态进行分析。在细胞遗传学、现代分类学、
4、生物进化和遗传育种学等研究中是重要的研究手段。对于任何一个染色体的基本形态特征来说重要的参数有以下3个:1相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度100% 2臂指数=长臂/短臂 反映着丝粒位置的指数 3着丝粒指数=短臂/整个染色体长度100%反映着丝粒位置的指数三、实验仪器试剂及材料1、材料:人的静脉外周血。组内选取男女各一名取血样。2、试剂：RPMIl640培养基（完全培养基）、浓度为10mg/ml的PHA（植物血球凝集素）、0.1mg/ml秋水仙素溶液、Giemsa染液、低渗溶液（用KCl配制）、NaHCO3（配细胞培养完全培养基时用于调PH）、Carnoy固定
5、液（9ml纯酒精+3ml冰乙酸）等。3、器材：恒温培养箱、恒温水浴箱、离心机、分析天平、显微镜、超净工作台、移液管、离心管、培养瓶、试管架及试管、镊子、量桶、烧杯、酒精灯、染缸、染色架、胶头滴管等。四、实验方法一、各种试剂及培养基的配制方法（供实验中分析与参考，若实验室已提供就不再配制） (1)RPMI-1640基础培养基的配制称取RPMI-l640培养粉9.8g溶于1000mL蒸馏水中,经G6型号细菌过滤漏斗中0.45微米与0.22微米的滤膜抽滤后备用。使用前最好做热源培养以确保实验顺利进行。(老师提供)(2)5%NaHCO3的配制称取5gNaHCO3,溶于100mL蒸馏水中,高压灭菌备用。
6、(3)生理盐水的配制称取0.85gNaCl溶l00mL蒸馏水中高压灭菌备用。(4)PHA(植物血球凝集素)的配制称取PHA50mg配制成浓度为lmg/mL(生理盐水配制)的溶液。由于PHA使用量较少,配制时使用注射器式无菌过滤器,以减少药品损失。（老师提供，浓度为10mg/ml）(5)肝素溶液的配制40ml生理盐水溶解粉末160mg（每mg含126单位）配制成500单位/ml，8磅15min灭菌。（不用配，医院提供）(6)双抗溶液的配制将青链霉素用生理盐水按效价单位配成l0万单位/mL,配制过程要求使用注射器式无菌过滤器.(7)秋水仙素溶液的配制用生理盐水配制成浓度为40微克/mL秋水仙素溶液
7、,使用注射器式无菌过滤器进行除菌操作。（老师提供，浓度为0.1mg/ml）(8)低渗液溶液的配制称取5.59gKCl溶于1,000mL双蒸馏水中,配制成溶液浓度为0.075mol/L的低渗液溶液。（该溶液自己配）(9)细胞培养完全培养基的配制在每个培养瓶中加入RPMIl640基础培养基2mL,小牛血清0.5mL,肝素1滴（0.01ml），PHA 2滴（0.2 ml），加入双抗3滴（0.025ml），NaHCO3调pH至7.2-7.4。（老师提供）(10)固定液的配制9ml纯酒精+3ml冰乙酸。（自己配制）(11)Giemsa（吉姆斯）染液（自己配制）Giemsa原液配制称Giemsa粉末0.5
8、g加几滴甘油研磨再加入甘油，使加入的甘油总量为33ml。56中保温90-120min。加入33ml甲醇后置棕色瓶中保存。使用时按要求用PBS稀释，一般稀释10倍。注:PBS含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液(简称为PBS-T)配制方法为：PBS缓冲液（pH7.2-7.4）：NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO44.3mmol/L，KH2PO41.4mmol/L。PBS缓冲液一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用，具体试剂一般也有不同的比例配方，在针对性上就有了更好。二、实验操作方法1.实验所用药品及器皿的无菌处理(1)实验用的所有器皿,器具都必须按规定洗
9、净,高压灭菌处理备用。器具清洗方法：清洗 烘干 浸酸 流水冲洗（不少于8-10次） 蒸馏水冲洗（23次） 烘干 包装 灭菌（注：包装方法见细胞培养操作视频）(2)实验用全部药品都要经高压灭菌或过滤除菌处理，具有生物活性的药品要经G6型号细菌过滤漏斗抽滤除菌,其它药品可经过高压灭菌。2.采取血样选一名女组员与一名男组员去校医院各采3ml肘静脉血，采集后加入肝素后立即拿回实验室进行实验（采血时加入肝素应适中，不宜太多，医院提供）。在无菌条件下向含有3mlRPMI-1640培养基（完全培养基）的培养瓶中接种0.18ml全血,然后加入60umlPHA，使PHA终浓度为0.2mg/ml,轻轻摇匀。男女血
10、样各2份，盖紧瓶盖，贴好标签。注：进入工作间前应按正确要求操作（如穿脚套、洗手并对手用酒精擦拭等），操作者应正确使用超净工作台，操作过程中应严格操作，防止污染3.血细胞培养贴好标签后，将4瓶装有血细胞的培养瓶置于37培养箱中培养66-72h（培养期间每隔6h晃动一次培养瓶，防止细胞结块；若培养期间出现膜状物应在无菌条件下去除；培养时瓶口应盖紧，防止pH发生较大变化，若出现培养液呈黄色，则应在无菌条件下加无菌的0.14%碳酸氢钠溶液调整或再加入0.61.5ml培养液来校正），各培养瓶条件如下：培养瓶瓶标号完全培养基（ml）血量（ml）秋水仙素终浓度（ug/ml）秋水仙素作用时间（h）10mg/m
11、lPHA（微升）1（男生）30.180.4(12uml)4602（男生）30.180.5(15uml)3603（女生）30.180.4(12uml)4604（女生）30.180.65(19.5uml)3604.收集细胞将培养瓶从温箱取出，用吸管将贴壁细胞冲散均匀，轻轻吹打使细胞混匀，移到离心管中以1000rpm/min离心8min，弃上清液，每瓶培养细胞各一管。（以下染色体制备过程组内成员分为四组，保证实验同步）5.低渗处理向四管中均先加入1mlmol/LKCl溶液，轻轻吹打，使细胞重悬，然后补加6mlKCl溶液，37低渗20min。（低渗时低渗时间可分为15、18、20、22min四个级别）
12、 6.预固定沿管壁慢慢加入1ml新配carnoy氏固定液，轻轻吹打混匀，1000rpm/min离心8min，去上清液。7.固定沿管壁慢慢加入6ml固定液，用吸管轻轻地吹打，使细胞分散，固定20min，离心去上清夜。8.重复固定取上清液，再重复进行7过程。9.滴片沉淀物中加入6ml固定液，用吸管吹打使其成为细胞悬液。用镊子取预先冰冻的干净载玻片，迅速滴上2-3滴细胞悬液（滴片高度至少在0.5m以上，注意滴2-3滴），立即用嘴向同一方向吹气，使细胞分散均匀，然后置酒精灯上微微加热干燥或空气干燥（滴片张数尽量多，保证每人至少四张装片不同培养条件下的装片各一张）。冰冻干净载玻片制备方法：浸酸 自来水冲
13、洗 烘干 80%酒精浸泡 冰冻10.染色滴有细胞悬液的载片反扣在染色板上，使片、板之间有一缝隙，将稀释后的Giemsa染液滴在片隙中，染色20min（或放于染缸中），自来水冲洗，吹干。（应特别注意染色过程与染色方法，保证染色不出错）11.镜检在低倍镜找到处于中期分裂相的细胞，然后在转至高倍镜下观察。观察时要使用推进器座标尺记录分散良好的细胞位置，便于重新查找，选择染色体分散好、长度适中、姐妹染色单体清楚的中期分裂相进行显微观察。人类每个体细胞有46条染色体，根据染色体的长度和着丝粒位置的不同，可以分成22对常染色体和一对性染色体。男子是46，XY，女子是46，XX。（注：镜检时安排组员两人进行
14、，其他成员继续制作染色体装片，检查到好的装片时马上安排人进行核型分析）12.染色体组型分析1)在显微镜下找出染色体分散良好、长度适中、姐妹染色单体清楚的中期分裂相进行显微拍摄。2)将显微拍摄放大的照片上的一个细胞的全部染色体分别一条一条剪下。3)跟据染色体的长短和形态特征进行同源染色体的目测配对。4)测量出每条染色体短壁和长臂长度，计算出各条染色体的相对长度、着丝粒指数、臂指数，记录原始数据。5)根据测量数据校正目测配对排列结果进行调整排列。6)把染色体按一定顺序一对一对的排列，排列时注意短臂向上，长臂向下，性染色体单独排列，最后把染色体贴成一完整的染色体核型图。7)翻拍。（注：制片与核型分析
15、必须衔接，定在一天完成）14.若实验效果不佳且时间允许，则重复染色体制备过程或在条件允许下重新实验。五、注意事项 1 细胞培养的环境必须无污染环境，温度保持恒定，有适宜气体环境，pH适宜。2 操作及培养条件、培养仪器等无菌避免污染。3 各种试剂严格按要求使用，避免试剂使用中的过量与不足。采集血种时不要加入过多的肝素，肝素过多可能引致溶血和一些淋巴细胞转化分裂，且接种时血样愈新鲜愈好避免过长时间保存影响活力。PHA的质量是人体淋巴细胞培养成败的关键，效价低或用量不足则培养效果差，但浓度过大红细胞凝固会影响细胞生长。4 掌握好秋水仙素的浓度和处理时间，浓度过高处理时间过长都会使染色体过分收缩，不利于形态观察。5 控制好离心速度，过快或过慢都会影响实验结果。6 低渗处理是实验成败的关键，其目的是使细胞体积膨大，染色体松散，处理时间过长染色体丢失会影响观察，处理时间不足，细胞内染色体会聚集在仪器无法区分。附表染色体序号绝对长度（um）相对长度（100%）长臂长度（um）短臂长度(um)臂比(长/短)染色体类型1
