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1、分子生物学实验常见问题分析及对策-20质粒的提取常见问题与对策Q1: 提质粒没有明显的沉淀，能说明是没有提出来吗？跑完电泳还是没有条带能证明质粒没提出来吗？A: 提质粒的时候没有明显的沉淀，也有可能是由于你加的乙醇量少或异丙醇量不足或质量有问题。或者质粒太少了难以用肉眼看出。跑完电泳还是没有条带也有可能是跑胶时配置胶出问题，或染色剂不够，或者你加的质粒量少。要具体情况再分析Q2:质粒条带很暗而且通常只有一条带是什么问题？A:没有用试剂盒提取的话可能考虑技术问题。如果常做质粒的提取，且用的是试剂盒，还出现这种情况，就要从质粒本身着手考虑了：首先做个PCR鉴定一下，确保有质粒的情况下，很可能质粒是
2、低拷贝的，如此就要用大量的细菌来提取质粒。一般的用可以用水煮法提(1ml菌液离心,沉淀加50l DEPC 水,100度水煮3-4分钟,离心取上清夜,含有大量的质粒)用1-2l作为模板跑PCR效果很好。Q3: 用分光光度计测得的质粒浓度很高，但是跑出来的电泳却看不到条带，这是什么原因？A: 三种可能：1）可能EB有问题，应同时检查同一块胶上其它样品是否有条带。2）计算OD260/280比例，有可能为蛋白污染所致。3）稀释后上样的浓度过低。Q4: 提质粒电泳显示应该几条带？哪种情况较好？A: 质粒在电泳时会出现三种情况的图谱：1）三条带，按照电泳泳动速度（快到慢）排列为：超螺旋、缺口闭环、开环。经
3、常会出现。2）两条带，超螺旋/闭环/开环 任意两种。3）一条带，超螺旋。至于那种情况好，要看我们进一步实验的目的了。1）进行分子克隆的操作，构建载体。这随便那种情况都可以，不会影响你的后续实验。所以在这种情况下，没必要评比谁好谁不好。2）进行细胞转染。因为转染必须要超螺旋，所以它们的质量好坏顺序是： 3）、2）、1）。Q5: 如何降低质粒变性超螺旋的含量？A: 理论上，用碱裂解法抽提质粒，变性超螺旋的出现是不可避免的。之所以大家没有非常在意，一是因为它的存在似乎对酶反应没有任何影响，二是因为它的含量并不一定高到被用电泳观察到。抽提使用相对过剩的溶液，在加入溶液 II 后，体系能在 1 分钟内变
4、澄清，再快速加入溶液 III，这样基本上能将变性超螺旋的出现控制在电泳看不见的水平。 (变性超螺旋电泳时比正常超螺旋跑得快一点点。)Q6: 质粒大小如何在电泳中的鉴定？A: 1.从细菌中大量提取的质粒电泳时，不一定均出现三条带，有时会出现两条，甚至一条(一般是超螺旋的质粒)，这跟上样量也有些关系。出现不同的结果都是由抽提质粒时的操作手法造成的。如果严格按照操作步骤，超螺旋的质粒会较多。2.酶切将质粒线性化以后，才可以用marker判断大小。如果有三种构像，可以用中间那条带与marker比较判断大小。3.商品化的质粒估计应该大部分是超螺旋构像。4.酶切后线性化条带电泳时所处的位置就指示质粒的大小
5、。Q7:首次进行小量制备质粒时，有时会发现质粒不能被限制酶所切割是为什么？A: 这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。如果总是依然存在，可用离心柱层析注纯化。Q8: 大提质粒产量低的原因是什么？A: 大体积摇菌时，注意培养基最多只能占摇瓶体积的1/4，单纯地增加摇速是没有用的。另外，加溶液I裂解时，要注意充分裂解。你的溶液II加入后，溶液没有澄清，说明一是菌体没有裂解好，二是溶液II的酸碱度有问题或者其他原因。在溶液II没有完全澄清的情况下，加入溶液III, plasmid就会包裹在基因组的粘团之中，随
6、沉渣一起被沉淀下来。不信你把沉渣再加入溶液II和III,会再提出一部分质粒出来。建议可使用Kit以提高质粒产量。Q9: 小提质粒的产量很高，但大提的产量不高，如何注意大提质粒的手法和细节？A: 1. 溶液1，5ml；溶液2，10ml；溶液3，7.5ml2.加溶液2后，缓慢颠倒数次，见到蛋清样液体挂在离心管壁上，开离心管盖后，有拉丝现象。3.异丙醇后，烤沉淀的时间不宜太长，质粒烤得太干，一是有损失，二是难溶。4.加TE溶解质粒时，如果30分钟后还不溶，可能是TE中，质粒达到过饱和，补加适量的TE即可Q10: 超过10K的质粒转化要注意什么问题？A: 选择高效转化效率的感受态细胞，DH5a可以做为
7、较大质粒的宿主菌。Q11:沉淀质粒DNA的方法有哪些？可以用什么代替无水乙醇？A: 用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67左右。因而也可改用95乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95乙醇昂贵）。但是加95的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙
8、醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置1530分钟即可。Q12: 加核糖核酸酶降解核糖核酸后，需不需要再要用SDS与KAc来处理？为什么？A: 需要。加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好效果。Q13:在保存或抽提DNA过程中，一般采用什么缓冲液？为什么？A: 采用TE缓冲液。在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则
9、是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2产生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。如下游有特殊需要也可用水保存DNA。Q14:
10、 如何选择聚乙二醇（6000）的浓度来沉淀DNA？A: 采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同，PEG的浓度低，选择性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的浓度只需1左右，小分子所需PEG浓度高达20。本实验选择性沉淀4.3kb的pBR322质粒DNA，每毫升加入0.4毫升的30 PEG，其最终PEG浓度为12。PEG选择性沉淀DNA的分辨率大约100bp。Q15: 用酚与氯仿抽提质粒DNA时，还要加多少量的异戊醇？A: 在抽提质粒时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，
11、所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。Q16: 为了提高质粒的转化效率, 实验中要考虑几个重要因素？A: 1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5107 个/m
12、l左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50l 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管
13、, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。Q17:质粒抽提的关键性控制因素有哪些？A: (1)摇菌时间过夜培养是一个普遍接受的概念，而且适合大部分情况。如果出现了问题，调整培养时间会有帮助：Nick 多，则增加培养时间；酶切出现问题，则减少培养时间。(2)起始菌体量不仅只是“从多少 ml 菌液中抽提质粒”，一定要养成每次都观察菌体量的习惯，因为质粒毕竟是在菌体中，而且，抽提质粒所用的试剂量，都只与菌体量有关。(3)菌体的彻底悬浮如果没有彻底悬浮菌体
14、，则残留的菌体团块在溶液 II 加入后，变成一个外围几乎彻底裂解，往里不完全裂解，中间没有裂解的团块。这个团块在溶液 III 加入后，会有一部分蛋白质继续存在于溶液中，成为蛋白质残留的最大根源。(4)使用相对过量的试剂这是适合所有核酸抽提的建议。试剂相对过量的好处是：稳定性好，纯度高，操作更简单。如果认为这样不经济，就少用一点菌体。(5)裂解时间加入溶液 II 后，混匀，体系最好能立即变得清澈。体系如果变得清澈了，马上加入溶液 III 中和。如果体系不马上变清澈，下次少用一点菌液，或者多用一点溶液。如今的质粒设计得越来越复杂了，奇怪的现象也越来越多，而所有的奇怪现象，多与裂解时间有关。(6)中
15、和的操作在 1.5ml 离心管中加入溶液 III 后，先颠倒两次，使管底朝上，用指头弹击管底数次，再颠倒混匀。效果非常好。(7)中和后的离心去蛋白一定要将蛋白质彻底离心下去。如果发现离心后仍然有蛋白质漂浮在液面，继续离心的效果并不好；而将上清倒入另外一个离心管中，再离心，效果要好许多。Q18: 用碱法大提质粒最后误用的10倍TE溶解沉淀，对质粒有影响吗？如何补救？A: 离子浓度可以影响DNA的稳定性，时间长了会导致DNA断裂等。离子浓度过大可能会影响下游的操作，当然这只是可能；简易将质粒重新沉淀一下：加1/10体积 3M ph5.2的醋酸钠、2倍体积的无水乙醇沉淀即可，这一步还有纯化作用，当然
16、也可以重新离心，再换水溶解或1倍TE溶解。Q19: 如何降低 RNA 残留？A：RNA 的去除，首先是使用 RNase 消化。在溶液 I 中加入高浓度的 RNase A (100ug/ml)，或者用含 25ug RNase A/ml TE 溶解抽提好的质粒，都可以降低 RNA 残留，但都不能彻底去除。幸运的是，RNA 的残留并不影响酶切等最常用的用途。如果想彻底去除 RNA 残留，可以用试剂盒，或者使用对4个碱基都作用的 RNase。Q20：如何降低 gDNA 残留？A: gDNA 的残留问题，必须在抽提过程中解决，否则，就只能用胶回收方法处理了。gDNA 越大，越难于复性，也就越容易被去除；所以，一定要尽可能不打断 gDNA。裂解体系越
