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1、第二章1、目前，常用的植物细胞培养基种类有哪些？各有什么特点？1）MS培养基 特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的平衡溶液。2）B5培养基 其主要特点是含有较低的铵，这是因为铵对不少培养物的生长有抑制作用。3）White培养基 其特点是无机盐数量较低，适于生根培养4）N6培养基 其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。5）KM8P培养基 其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合培养。2、简要说明MS培养基的基本组成。1）大量元素母液配制 MS培养基的大量元素主要包括硝酸铵（NH4NO3）、硝酸钾(KNO3)、磷酸二氢钾（KH2PO4）、硫酸镁（M
2、gSO47H2O）和氯化钾（CaCl2,CaCl22H2O）五种化合物。2）微量元素母液配制 MS培养基的微量元素由7种化合物（除Fe外）组成MnSO44H2O、ZnSO47H2O、H3BO3、KI、NaMoO42H2O、CuSO45H2O、CoCl26H2O。3）铁盐母液配制 MS培养基中的铁盐是硫酸亚铁（FeSO44H2O）和乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）的螯合物，必须单独配成母液。4）有机母液的配制 MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、烟酸硫胺素和盐酸吡哆素。5）激素母液配制 MS培养基中的激素有生长素类、细胞分裂素3、配制培养基时，为什么要先配制母液？如何配制母液？1）配制母
3、液不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，而且还便于低温保藏。2）基本培养基中的大量元素、微量元素、维生素等一般都分别配制成母液。4、常用的灭菌方法有哪些，各有哪些优缺点？1）湿热灭菌（高压蒸汽灭菌） 优点：高温高压蒸汽对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡，是一种最有效的灭菌方法。 缺点：如果是对培养基或液体溶液灭菌，灭菌时间与需要灭菌的培养基或液体溶液的体积密切相关，时间不足达不到灭菌效果，时间过长培养基内的化学物质遭到破坏，影响培养基成分。2）过滤除菌 优点：3）干热灭菌 缺点：干热灭菌存在能源消耗大、浪费时间、安全性差问题4）紫外线灭菌 缺点：由于紫外线
4、穿透物质的能力很弱，所以只适于空气中和物体表面的灭菌，而且要求距照射物质以不超过1.2m为宜。5）熏蒸消毒 优点： 方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。6）药剂喷雾消毒 5、动物细胞培养常用的培养基组成成分有哪几类，在离体培养过程中有哪些作用？1）天然培养基 对促进细胞生长繁殖、粘附及中和物质的毒性有一定作用。2）合成培养基 血清的加入对培养非常有效，但对培养产物的分离纯化和检测会造成不便。3）无血清培养基 细胞外基质能帮助细胞附着和铁壁；低分子营养成分是细胞生长和代谢所需的；激素与生长因子促进细胞生长繁殖；酶的抑制剂，保护细胞不受培养基内残留酶的损伤。6、初代培养时，接种的一般程序是什
5、么？1）在接种前打开超净工作台紫外灯照射2030min，关闭紫外灯后，打开超净工作台的风机10min以上，开始无菌操作。2）接种人员先洗净，在缓冲室内换好经过消毒的工作服，带上口罩，并换上拖鞋等。3）上超净工作台后，用酒精棉球认真擦拭双手，特别是指甲处，然后擦拭工作台面及四周，装有培养基的培养器皿和盛外植体的烧杯也要用酒精擦拭消毒后，再放进工作台。4）先用酒精棉球擦拭接种工具，然后在酒精灯火焰上进行灼烧灭菌或放在接种器械灭菌器中灭菌，灭菌后放在器械架上使其自然冷却。5）把植物材料放在75%乙醇中浸泡约30s，再用0.1%的升汞中浸泡510min，浸泡时刻进行搅动，使植物材料与消毒剂有良好的接触
6、，然后用无菌水冲洗35次。6）接种时培养瓶瓶口要在酒精灯火焰附近，并在接种前后灼烧瓶口。7）接种结束后，清理和关闭超净工作台。7、配制培养基时，加入一定量的植物生长调节物质，它们在离体培养过程中有哪些作用？植物激素是植物细胞生长最适宜的调节物质，它能诱导细胞分裂、愈伤组织再分化以及胚状体发育。植物激素主要包括生长素类、细胞分裂素类和赤霉素类，有时也使用脱落酸、乙烯等物质。8、什么是生物安全实验室？目前，生物安全实验室的种类有哪些，各有什么特点？1）生物安全实验室是指对由动物、植物和微生物等生物体给人类健康和自然环境可能造成不安全的防范，主要是针对病原微生物或具有潜在危害的重组DNA等生物危险的
7、方法而建起的安全实验室。2）BSL-1(P1) 对动、植物和环境危害较低、不会引发疾病BSL-2(P2) 对动、植物和环境有中等危害或具有潜在危害的致病因子BSL-3(P3) 可通过气溶胶使人传感上严重的甚至是致命的致病因子，对动、植物和环境有高度危害；通常有预防治疗措施。BSL-4(P4) 对动、植物和环境有高度危险性；通过气溶胶途径传播途径不明，没有预防措施第三章1.基本概念细胞的全能性：是指细胞具有发育成完整个体的遗传潜能。也可以指个体某个器官或组织已经分化的细胞在适宜的条件下再生成完整个体的遗传潜能。外植体：是指由活体植物体上提取下来的，接种在培养基上用来进行离体无菌培养的离体材料，可
8、以是器官、组织、细胞和原生质体等。愈伤组织：脱分化后的细胞经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性的松散的细胞团，称之愈伤组织（callus)极性：通常是指在器官、组织甚至细胞中，在不同的轴向上存在某种形态结构和生理生化上的梯度差异。细胞分化：是指发育起始状态的合子沿个体发育方向不断分化出形态结构、生理功能不同的细胞、组织、器官而最终形成完整植株的过程。即由于细胞的分工而导致其结构和功能改变或发育方式改变的过程。在细胞水平上，细胞分化是指细胞在形态、结构和功能上发生改变的过程。去分化：已有特定结构和功能的植物组织，在一定的条件下，其细胞被诱导改变原有的发育途径，逐步失去原有的分化状态，转变为具
9、有分生能力的胚性细胞的过程叫脱分化或去分化（dedifferentiation)。再分化：脱分化细胞失去了分化的特征，但在特定条件下，可再次开始新的分化发育进程，最终形成各种组织、器官或胚状体等，即再分化（rededifferentiation) 体细胞胚： (somatic embry)又称胚状体，是指离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物。人工种子：（artificial seeds）又称合成种子（synthetic seeds）或体细胞种子（somatic seeds）。就是将离体培养中产生的胚状体或芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中形成的类似种子的颗粒。2.愈伤
10、组织的形成大致可分为几个时期？各有何特点？答：可分为三个时期：（1）启动期 (诱导期)：主要是指细胞准备分裂的时期,需要采用合适的诱导剂,如NAA(萘乙酸)、IAA （吲哚乙酸）、2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）等或细胞分裂素。 特征：距伤口较近的薄壁细胞略有增大，细胞质开始增多，相应的液泡缩小，核变大，呈球形，并由细胞边沿向中央移动；核仁明显变大，RNA含量增加，细胞恢复到具有分裂能力的状态，进入分裂的准备阶段，开始脱分化。 （2）分裂期：进入分裂期就是脱分化的完成，同时也是再分化的开始。特征：被启动的细胞全面地进行活跃分裂。启动分裂的细胞体积变小，细胞内有旺盛的物质合成，并逐渐恢复到分生
11、组织状态。如果此时经常更换培养液，愈伤组织就可以无限制地进行分裂而维持不分化状态。 （3）分化期（形成期）：细胞内部开始发生一系列形态和生理的变化，分化出形态和功能不同的细胞。特征：这一时期与分裂期没有明显界限，一方面细胞不断分裂增殖，形成愈伤组织，另一方面细胞开始再分化。3.愈伤组织有何生长特征？答：（一）生长特性1、愈伤组织的类型根据组织学外观特征及其再生方式分为：胚性愈伤组织（EC）：质地较坚实，颜色有乳白或黄色，表面具有球形颗粒，生长缓慢。又可分为：致密型、易碎型。非胚性愈伤组织（NEC）：松疏易碎，颜色有黄色或褐色，表面粗糙，生长迅速。一般只有胚性愈伤组织有再生能力。某些植物的非胚性
12、愈伤组织经适当继代培养可转变为胚性愈伤组织。4.外植体的发育程度对愈伤组织的诱导和继代有何影响？答：在胚性愈伤组织的诱导中，外植体的发育状态是一个十分重要的因素。外植体在发育过程中，存在一个很短暂的时期，此期外植体内的某些细胞处于未分化或部分分化的状态，这些细胞具有形成胚性愈伤组织的能力，而处于这一发育时期之前或之后的外植体都只能形成非胚性愈伤组织。因此，选择适宜的取材时期可获得理想的培养结果。5、培养条件下的器官发生有哪些方式？影响其发生的因素有哪些？答：（1）有直接发生与间接发生两种途径。（2）影响其发生的因素有：1、外源激素的影响2、物理因素：光照、温度3、外植体的生理状态4、培养物的年
13、龄6、生理学说、遗传学说和竞争学说各如何解释长期培养物形态发生潜力丧失的现象？答：1生理学说随着不断的培养继代的进行，培养组织或细胞中的内源激素平衡关系可能会发生改变，而导致不能形态发生。在这种情况下，细胞虽然停止了器官和胚胎的分化，但并不一定就丧失了这种分化能力。因而，在这种情况下，如果改变外部培养条件，应该有可能使细胞的这种内在潜力得到恢复。2 遗传学说该假说认为，形态发生潜力的丧失是由于在培养细胞中的核的特性发生了改变，即细胞核内的遗传物质在培养继代过程中由于变异等原因而发生了改变或是突变。因此，可以推知，由这种原因所造成的形态发生潜力的丧失是不可逆的。 3竞争学说 首先，细胞对于生长素
14、（2，4-D）抑制全能性表达的作用变得比较敏感； 其次，随着时间的推移，由于培养细胞在细胞学上的不稳定性，出现了缺乏胚性潜力的新的细胞系，这些细胞学上的变化不一定是染色体数目的变化，而可能只是遗传信息的小的突变、丢失或易位， 按照这种假说，如果非胚性的细胞类型在所用的培养基中具有生长上的选择优势，在反复的继代培养中，非胚性细胞的群体将会逐步增加，而胚性成分则逐渐减少。到了一定时期之后，在培养物中已不再含有任何胚性细胞，这时若想再恢复它们的胚胎发生能力就不可能了。然而，如果在培养物中存在少量胚性细胞，只是由于处在支配地位的非胚性细胞的抑制作用，这些胚性细胞的全能性无法表达，在这种情况下，通过改变
15、培养基成分，使之有选择地促进全能细胞的增殖，就应当有可能恢复该培养物的形态发生潜力。 7、离体培养条件下，茎、芽和根的再生方式有几种？答:离体条件下植物细胞全能性实现的途径 1、植物体细胞 2、植物性细胞 可诱导形成完整的植物体 3、植物原生质体4、融合的原生质体可发育成杂种植物5、转基因的植物细胞可发育成具有新性状的植物体8、影响器官发生的主要因素有哪些？答:1、外源激素的影响2、物理因素：光照、温度3、外植体的生理状态4、培养物的年龄9、何谓胚状体？胚状体与合子胚有何异同？答：胚状体 离体培养条件下，没有经过受精过程，但是经过了胚胎发育过程所形成的胚状类似物，此现象无论在体细胞培养还是生殖细胞培养中均可以看到，因而统称为体细胞胚或胚状体。异同 细胞胚具有两极性，而器官发生是单极的。细胞胚维管组织分布是独立的Y 字形结构，形成的再生植株遗传性比器官发生的稳定。10、离体培养条件下，胚状体的产生有几种方式？答：直接从外植体上产生体细胞胚 由愈伤组织产生 悬浮培养中由胚性细胞复合体表面产生 有悬浮培养中游离的单细胞产生 由单倍体细胞产
