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1、激光共聚焦技术与非损伤微测技术结合的优势点击次数：999 发布日期：2010-2-24 来源：本站 仅供参考，谢绝转载，否则责任自负2008年诺贝尔化学奖授予三位发现荧光蛋白的科学家，表彰他们对生命科学发展的重要贡献。荧光技术是现代生命科学研究中非常重要的技术，也是目前检测生物体样品内离子分子状态的最佳手段。激光共聚焦技术的出现，使荧光技术如虎添翼。通过共聚焦显微镜和飞秒红外激光器等部件的配合使用，不仅可以得到非常清晰的荧光图像，进行多重荧光标记的定位和定量分析，还具有图像三维重建、荧光共振能量转移谱测定甚至膜电位测定等功能，成为生命科学研究的重要技术手段。近年来，应用激光共聚焦技术发表的高水
2、平研究成果越来越多，受到生命科学家的广泛关注。但随着激光共聚焦技术应用范围的扩大，其在研究中的局限性也突显出来。激光共聚焦技术可以视为对荧光技术的重大改进，但并未对荧光技术作出本质改变，因而荧光技术的固有缺陷也在激光共聚焦技术上体现出来。首先，激光共聚焦技术主要获得的是生物样品内部的离子分子信息，这些离子分子信息的改变既可能源于样品内部离子分子源的变化，也可能源于样品内外的离子分子交换。这两种离子分子变化过程是由完全不同的生命机制引发的。尽管激光共聚焦技术也可以测量生物样品外部的离子分子信息，但存在许多问题影响测量的准确性。这导致共聚焦数据的重大缺陷，必须通过大量的后续实验才能得出比较准确的结
3、论。若单纯用激光共聚焦数据作为检测或诊断标准，往往面临很大的假阳性风险。其次，激光共聚焦测量时必须向生物样品内导入荧光物质，不仅操作过程复杂，而且这些荧光物质对样品活性有已知或潜在的影响，甚至可能导致样品生理状态改变，造成数据失真。这些问题已经成为激光共聚焦技术发展的瓶颈，严重制约了它的进一步应用。为克服现有激光共聚焦技术存在的问题，必须使激光共聚焦技术能够同时准确获得被测样品内外的离子分子信息并尽量减轻测试过程中对样品的损伤。现有的激光共聚焦技术体系要实现这两点非常困难，而激光共聚焦技术与非损伤微测技术的结合却可以轻松做到。非损伤微测技术是一大类选择性/特异性微电极技术的总称。1990年，非
4、损伤微测技术诞生于产生过多为诺贝尔奖获得者的美国MBL实验室（2008年诺贝尔化学奖得主之一下村修曾在该实验室工作多年）。与其他侵入式测量技术最大的区别在于，非损伤微测技术测试过程由电脑自动控制微电极运动，非常接近样品表面而不接触样品进行测量，获得样品外环境的离子分子的绝对浓度、流动速率和流动方向的信息。非损伤性测量是非损伤微测技术的重要特色，测试在与生物样品真实生存环境相似的液体中进行，不导入任何外源物质，最大程度保证了样品的生物活性和生理状态。也正由于测试过程中微电极不需要接触样品，使得非损伤微测技术被测样品范围非常广泛，从动植物整体、器官、组织、细胞聚集体、单个细胞到富集的细胞器均可。而
5、获得离子分子的流动速率和流动方向则是非损伤微测技术的鲜明优势，也是其他技术手段难以获得的重要信息。与浓度反映的离子分子静态信息相比，流动速率和流动方向反映的则是离子分子动态信息，样品外环境的离子分子流动速率和流动方向实质上表征的是样品内外离子分子的交换情况，更能反映生命活动过程的本质。除此之外，非损伤微测技术还具有多电极、长时间、多角度测量等特色。正因为非损伤微测技术的上述优势和特色，自诞生以来便获得了越来越广泛的应用，迄今已在Science、Nature等国际著名杂志发表论文百余篇。非损伤微测技术所获取数据和激光共聚焦技术获取的数据有很大互补性，两者结合可以同时准确检测样品内外离子分子的变化
6、情况，提供生命活动过程的完整信息，明确生命活动机制机理。非损伤微测技术可以测量生命活动中常见的五十多种离子和分子，覆盖了激光共聚焦技术的检测范围。而非损伤微测技术在测量时也需要配备显微镜，这使非损伤微测技术和激光共聚焦技术的结合有了硬件基础。早在2001年，葡萄牙学者在Nature Cell Biology发表研究论文，应用非损伤微测技术和激光共聚焦技术同时检测卵细胞与配子融合过程中卵细胞内外Ca2+的变化情况。非损伤微测技术检测发现，在融合一瞬间，胞外Ca2+有一个非常明显的内流，而此时激光共聚焦技术发现胞内Ca2+显著增加，如下图所示。这充分说明卵细胞和配子融合过程中胞内Ca2+的增加源于
7、对胞外Ca2+的吸收而非内源Ca2+释放，解决了长期悬而未决的科学难题。非损伤微测技术与激光共聚焦技术同时测量细胞内外Ca2+上述实例是非损伤微测技术和激光共聚焦技术结合的滥觞。非损伤微测技术和激光共聚焦技术的结合瞄准当今生命科学界以揭示生命活动机理和功能为主要研究内容的潮流，全面反映生命活动的信息，所产出数据有很强的说服力，易于产生高水平研究成果。来源：旭月（北京）科技有限公司联系电话：010-82622628；010-62656315；010-62523549E-mail：【点击可查看 旭月（北京）科技有限公司 相关产品】激光共聚焦扫描显微镜简介http:/Nancy(2010-07-14
8、 13:34:09)一、 激光共聚焦显微镜的基本组成激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope LSCM)是20世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品，是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器。激光共聚焦显微镜利用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦的原理和装置，以及通过针孔的选择和PMT的收集，并带有一套对其所观察到的对象进行数字图像分析处理的系统软件。与传统光学显微镜相比，它具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点。所以它问世以来在生物学的研究领域中得到了广泛应用。激光共聚焦显微镜主要有四部
9、分组成：1、显微镜光学系统。2、扫描装置。3、激光光源。4、检测系统。整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。1.1显微镜光学系统显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成象质量。显微镜光路以无限远光学系统可方便地在其中插人光学选件而不影响成象质量和测量精度。物镜应选取大数值孔径平场复消色差物镜，有利于荧光的采集和成象的清晰。物镜组的转换，滤色片组的选取，载物台的移动调节，焦平面的记忆锁定都应由计算机自动控制。1.2扫描装置LSCM使用的扫描装置在生物领域一般为镜扫描。由于转镜只需偏转很小角度就能涉及很大的扫描范围，图象采集速度大大提高，51251
10、2画面每秒可达4帧以上，有利于那些寿命短的离子作荧光测定。扫描系统的工作程序由计算机自动控制。1.3激光光源LSCM使用的激光光源有单激光和多激光系统。多激光器系统在可见光范围使用多谱线氩离子激光器，发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光，氦氖绿激光器提供发射波长为543nm的绿光，氦氖红激光器发射波长为633nm的红光，新的405nm半导体激光器的出现可以提供近紫外谱线，但是小巧便宜而且维护简单。1.4检测系统LSCM为多通道荧光采集系统，一般有三个荧光通道和一个透射光通道，能升级到四个荧光通道，可对物体进行多谱线激光激发，样品发射荧光的探测器为感光灵敏度高的光电倍增管PMT，
11、配有高速12位A/D转换器，可以做光子计数。PMT前设置针孔，由计算机软件调节针孔大小，光路中设有能自动切换的滤色片组，满足不同测量的需要,也有通过光栅或棱镜分光后进行光谱扫描功能的设置。二、激光共聚焦显微镜的特点以及在生物领域的应用传统光学显微镜相比，激光共聚焦显微镜具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点，在对生物样品的观察中，激光共聚焦显微镜有如下优越性：1、对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。2、可以得到比普通荧光显微镜更高对比度、高解析度图象、同时具有高灵敏度、杰出样品保护。3、多维图象的获得，
12、如7维图象(XYZaIt): xyt、xzt和xt扫描,时间序列扫描旋转扫描、区域扫描、光谱扫描、同时方便进行图像处理。 4、细胞内离子荧光标记，单标记或多标记，检测细胞内如PH和钠、钙、镁等离子浓度的比率测定及动态变化。5、荧光标记探头标记的活细胞或切片标本的活细胞生物物质，膜标记、免疫物质、免疫反应、受体或配体，核酸等观察；可以在同一张样品上进行同时多重物质标记，同时观察； 6、对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠和优良重复性；数据图像可及时输出或长期储存。 由于共聚焦显微镜的以上优点，激光共聚焦显微镜在以下研究领域中应用较为广泛：1、细胞生物学：如：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、
13、受体、细胞器结构和分布变化、细胞凋亡机制；各种细胞器、结构性蛋白、DNA、RNA、酶和受体分子等细胞特异性结构的含量、组分及分布进行定量分析；DNA、RNA含量、利用特定的抗体对紫外线引起的DNA损伤进行观察和定量；分析正常细胞和癌细胞细胞骨架与核改变之间的关系；细胞黏附行为等2、生物化学：如：酶、核酸、受体分析、荧光原位杂交、杂色体基因定位等，利用共聚焦技术可以取代传统的核酸印迹染交等技术，进行基因的表达检测，使基因的转录、翻译等检测变的更加简单、准确。3、药理学：如：药物对细胞的作用及其动力学；药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量 4、生理学、发育生物学：如：膜受体、离子通道、离子含量、
14、分布、动态；动物发育以及胚胎的形成，骨髓干细胞的分化行为；细胞膜电位的测量.荧光漂白恢复（FRAP）、荧光漂白丢失（FLIP）的测量等。 5、遗传学和组胚学：如：细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断； 6、神经生物学：如：神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递； 7、微生物学和寄生虫学：如：细菌、寄生虫形态结构； 8、病理学及病理学临床应用：如：活检标本的快速诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病的诊断； 9、免疫学、环境医学和营养学。如：免疫荧光标记（单标、双标或三标）的定位，细胞膜受体或抗原的分布,微丝、微管的分布、两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的
15、共定位；对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中的时空表达，荧光能量共转移（FRET）。我们实验室有两台共聚焦，现正准备买一台新的，对这个方面还比较熟目前共聚焦有三大厂商：奥林巴斯（olympus，日本），莱卡（leica，德国）和蔡司（zeiss，德国）。其中奥林巴斯价格最低，属于低档类型，功能方面与leica和zeiss差不多，在成像方面略差于leica和zeiss，不过olympus的共聚焦厂商允许你在上面搭建其它系统，而且售后服务都比其它两大厂商好。zeiss比leica价格还要高一点，属于高档类型的，成像效果好，用起来也比较方便，但他们公司的技术人员告知客户不能自己在上面搭建新的系统，这一点很麻烦。leica介于olympus和zeiss之间，性能也很不错。如果你实验室经费有限，建议买olympus，其实对于一般的实验都是可以的，没看到很多高档次的文章还不是用olympus confocal做出来的！如果经费充足的话，可以考虑leica或zeiss。希望对你有用！另外，第四大厂商（伯乐）biorad已被zeiss收购了，所以现在也只有三家可以考虑了。PS。我的一个师妹对这个方面更熟，她一直都在调研购买新的共聚焦方面的资料，准备购买一台，可谓专家级别的
