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1、 分泌蛋白质组研究进展【摘要】 分泌蛋白质组是指组织、细胞等分泌的全部蛋白质。分泌蛋白主要分布于体液和细胞质胞浆中，参与许多重要的生命过程。分泌蛋白质组的研究主要涉及分泌蛋白的制备、多维色谱或二维凝胶电泳分离、质谱鉴定及生物信息学分析等。本文主要介绍了分泌蛋白的合成途径、蛋白质组技术在分泌蛋白组研究中的应用、分泌蛋白组研究现状及存在的问题等。 【关键词】 分泌蛋白 分泌蛋白质组 蛋白质组 质谱 二维凝胶电泳Abstract secretion proteome refers to the organization, all the proteins secreted by cells and
2、so on. Secretory protein mainly distributed in the cytoplasm of body fluids and cytoplasm involved in many important life processes. Study group of secreted proteins secreted protein involved in the preparation, multi-dimensional chromatography or two-dimensional gel electrophoresis and mass spectro
3、metry identification and bioinformatics analysis. This paper describes the secreted protein pathway, proteins secreted protein of Group Technology in the application of group study, the secretion proteome Research and existing problems.Key Words secreted protein secreted proteome proteomics two-dime
4、nsional gel electrophoresis mass spectrometry1 引言分泌蛋白(secretory protein)参与细胞信号的传导细胞增殖、分化和凋亡的调控、生物体的发育等重要生命过程。了解不同发育、生长时期和不同生理、病理条件下及不同类型细胞分泌蛋白表达的特点对认识生命过程具有重要意义。分泌蛋白质组的研究有助于找到直接与特定生理或病理状态相关的生物分子，为从分子水平上认识疾病的发生和发展过程提供理论依据，也为设计作用于特定靶分子(target molecule)的药物筛选奠定基础。目前利用蛋白质组学(proteomics)技术对分泌蛋白进行着广泛和深入的研究，
5、即分泌蛋白质组(Secretome)1。本文就分泌蛋白组以及相关研究进展做一综述。2 分泌蛋白的合成与转运不论原核生物还是真核生物，在细胞浆内合成的蛋白质或者定位于细胞的特定区域，或者分泌出细胞。将蛋白质分泌出细胞，真核细胞比原核细胞更困难，因为真核细胞结构复杂且有大量的膜性间隔。目前研究发现主要通过以下途径进行分泌蛋白的合成和转运。2.1 常规蛋白质的分泌途径分泌蛋白的合成是在细胞基质中开始的。近年来主要为信号假说(Signal hypothesis)，即协同翻译(cotranslation)来解释分泌蛋白质的分泌过程2。首先在N端合成一段含1626个疏水性氨基酸残基的多肽，称为信号肽(si
6、gnal peptide)。这段多肽能够起到信号的作用，引导肽链进入内质网腔，当多肽链延伸至80个左右氨基酸时，信号肽指引正在合成的多肽链穿过内质网膜，转移至内质网腔中。内质网腔面上的信号肽酶将信号肽切除，多肽链继续延伸，直至完成整条多肽链的合成。在多肽链从内质网通过高尔基体运输到细胞表面的囊泡之后，高尔基体产生的分泌小泡与质膜融合，泡内的蛋白被释放到胞外空间。信号肽中没有其它保守序列，也没有酸性基团。不同分泌蛋白的信号肽是不同的，如前白蛋白原(Preproalbumin)的信号肽是MetLysTrpValThrPheLeuLeuLeuLeuPheIle SerGlySer AlaPheSer
7、Arg3，前2u球蛋白(2uGlobulin)的信号肽是MetLysLeuLeuLeuLeuLeu LeuCysLeuGlyLeuThrLeuValCysGlyHisAlaGluGlu4。进入内质网腔的多肽链还要经过各种修饰加工，如糖基化(glycosylation)、羟基化(hydroxylation)、酰基化(acylation)和二硫键(disulfide bond)的形成等。糖基化伴随着多肽链的合成同时进行，是内质网中最常见的多肽链加工方式。在内质网腔中加在多肽链上的寡糖链，还要在高尔基体中进行一系列复杂的加工才能成为有活性的分泌蛋白。在合成过程中，多肽链在内质网腔中要进行折叠，不能正
8、确折叠的多肽链一般不能进入高尔基体，而在内质网腔中很快被降解。2.2 非常规蛋白质的分泌途径(nonconventional protein export)非常规蛋白分泌途径又称为不依赖内质网/高尔基体的蛋白分泌途径。大部分分泌蛋白都是由常规途径即内质网/高尔基体途径分泌至胞外的，但近年来研究发现，有少数真核细胞蛋白的分泌并不依赖于内质网/高尔基体途径，而是通过其它途径分泌。利用这些途径的有某些血管生成因子、炎症相关的细胞因子、调控细胞分化增殖和凋亡的细胞外基质组分、病毒蛋白、参与感染宿主的寄生虫蛋白等。常见的非常规分泌途径的蛋白有白介素1b(interleukin 1b, IL1b)、利什曼
9、原虫的HASPB蛋白、 半乳糖苷结合蛋白1(galectin1)、纤维原细胞生长因子1和2(fibroblast growth factor，FGF1、FGF2)、硫氧还蛋白等57。真核细胞蛋白非常规分泌途径的存在主要基于以下现象：这些分泌蛋白缺少常规的信号肽；缺少依赖内质网/高尔基体的翻译后修饰(posttranslational modification)，如N糖基化(Nlinked glycosylation)；对依赖内质网/高尔基体蛋白分泌途径的抑制剂 Brefeldin A(一种破坏高尔基体结构和功能的药物)有抗性等。非常规蛋白分泌过程被细胞分化、NFkB依赖的信号传导途径和转录后修
10、饰，如磷酸化(phosphorylation)等所调控8。 3 分泌蛋白质组研究的技术和方法不同发育、生长期和不同生理、病理条件下，不同类型细胞表达的蛋白是不一致的。因此，对蛋白质表达的研究应该精确到细胞甚至亚细胞水平。传统蛋白质研究注重单一蛋白质，而蛋白质组学则研究某一组织或细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质，注重研究参与特定生理或病理状态的所有种类蛋白质及其与周围环境(分子)的关系9。由于分泌蛋白在生物体中参与多种重要生理过程，对生物体的某一特定状态或其全部相关分泌蛋白即分泌蛋白质组的研究就显得很有必要。分泌蛋白质组是蛋白质组研究的分支之一,研究比较细胞或组织在不同生理或病理
11、条件下分泌蛋白质表达的异同，对相关蛋白质进行分类和鉴定后分析分泌蛋白质间相互作用和蛋白质的功能10。3.1 分泌蛋白制备方法 分泌蛋白质组学技术是以已有的蛋白质组研究方法和技术为基础，采用微纳升级流速多维液相色谱分离技术实现在线富集分泌蛋白(或肽段)及肽段分离，或利用同位素标记和荧光标记等方法示踪分泌蛋白在生物体内或细胞内的位置和移动，以纳升电喷雾电离串联质谱(nanoelectrospray ionization tandem mass spectrometry)技术或基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法 (natrixassisted laser desorption/ionization,
12、 MALDITOF MS)实现肽段鉴定。如Zwickl等11提供了一种代谢标签掺入的方法。放射自显影后可直接反映分泌蛋白,并克服残留物或死细胞对荧光显影方法的干扰，利用这种方法对HepG2细胞和人肝组织切片进行的研究结果证实其有广泛的临床应用价值。Huang等12利用毛细管超滤探针技术富集分泌蛋白，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术鉴定分泌蛋白质。Mbeunkui等13用tC2吸附填料对多种肿瘤细胞系的分泌蛋白富集后，采用二维液相色谱/电喷雾电离串联质谱技术对蛋白进行鉴定，平均每种细胞系鉴定出88个分泌蛋白。3.2 分泌蛋白质的分离和鉴定经典的蛋白质组分离技术是二维凝胶电泳(twodime
13、nsional gel electrophoresis，2DE)。二维凝胶电泳可以将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行分离，胶内酶切后在质谱系统中进行分析，从而得到蛋白质的定性数据。这些数据可以用于构建数据库或与已有的数据库进行比较分析14。但二维凝胶电泳的上样量相对比较大，而分泌蛋白的量相对较少。如果按常规电泳的上样量,由于高丰度蛋白的存在，将导致低丰度的分泌蛋白检测困难。因此，常规二维凝胶电泳不能完全满足分泌蛋白质组研究需要。为了适应分泌蛋白质组的研究和低丰度蛋白鉴定的需要，研制新型的色谱分离技术和高灵敏的质谱技术是完全必要的15。首先应对整个液相色谱系统进行研究和改进以适应对低丰
14、度蛋白质的分离。液相色谱技术的发展主要涉及两个方面：(1) 研制新型色谱填料，使其具有高耐压能力和尽可能大的比表面积等特性；(2) 泵系统能够提供较高的压力、稳定的低流速如超高压液相色谱（ultra performance liquid chromatography， UPLC）1618。目前多维液相的发展为分泌蛋白的分离、检测和分泌蛋白质组的深入研究奠定了分离基础1921。其次，质谱技术的发展为分泌蛋白质组的研究提供了关键的鉴定技术，如电喷雾电离技术(electrospray ionization，ESI)、基质辅助激光解吸电离技术(MatrixMALDI)。这些电离技术与不同类型质量分析器
15、，如四极杆分析器、离子阱分析器、飞行时间分析器和离子回旋共振分析器等联用组成不同类型的质谱仪。这些质谱技术的发展为分析低丰度的分泌蛋白在灵敏度和分辨率方面提供了可能2225。各种技术，如多维液相色谱、液相色谱毛细管电泳(LCCE)等与各种质谱离子化技术如ESI、MALDI等的联用，为深入研究分泌蛋白质组学提供强有力的技术支持。利用各种预分离技术富集分泌蛋白后，直接鉴定全分泌蛋白质组混合酶解产物也是目前分泌蛋白组研究的主要策略之一。3.3 生物信息学对分泌蛋白的验证通过蛋白质信号肽和跨膜区的分析也可确定备选的分泌蛋白。首先利用各种生物软件进行分泌蛋白的预测，如经典的信号肽预测软件SignalP、PSORT 、TargetP v1.01、PrediSi等2628。同时，无论信号肽存在与否，SecretomeP均可以较准确预测分泌蛋白，包括非经典途径的分泌蛋白29。Klee等30利用Target P预测人、猪等的分泌蛋白组。Chen等31综合了SwissProt、 TrEMBL、 RefSeq、Ensembl 和CBIGene等数据库后，构建了人、小鼠、大鼠的18152个分泌蛋白的数据库。因此，也可以从中挑选出某一种类的分泌蛋白有针对性的进行研究，这样就可以大大加快分泌蛋白组的研究32。同时面对液相色谱/质谱联用产生的大量数据，生物信息学还可以全面综合基因组学、蛋白组学和分
