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1、小鼠GV期卵母细胞的提取及其核质比分析作者：洪灯,符皎荣,张彦慧,钟南田,郑小桃单位：海南医学院组织学与胚胎学教研室，海南 海口 【摘要】目的：提取小鼠GV(germinal vesicle， GV)期卵母细胞并分析其核质比。方法：用挤压法从卵巢中分离获得GV期卵母细胞，放入DEPC-NS液体快速清除颗粒细胞，获得GV期卵母细胞裸卵，并计算其核质比。结果：用挤压法分离获得的GV期卵母细胞有一完整球形核，核膜明显，含有单个折光的核仁，胞浆中心稍变黑并呈颗粒状，共51枚，测得其卵径为(40.940±3.341)μm，核径为(15.020±2.236)μm，其
2、核质比为0.054±0.019。结论：用挤压法加DEPC-NS液体可快速破坏颗粒细胞之间的连接，便于迅速获得GV期卵母细胞裸卵;小鼠GV期卵母细胞的核质比为0.054±0.019，与其它物种同时相核质比在相同范围内，提示核质比是卵母细胞发育成熟的重要指标。 【关键词】 小鼠;GV期卵母细胞;挤压法;核质比 ABSTRACT Objective：To extract the GV-stage oocytes of mouse and analyzed its the nucleus-plasma ratio. Methods： GV-stage oocytes wer
3、e extracted and isolated by extrusion. Granulosa cells were quickly removed in DEPC-NS liquid and denuded oocytes were obtained. The nucleus-plasma ratio of the denuded oocytes was caculated. Results： The GV-stage oocytes had complete spherical nucleus with obvious nuclear membrane， and a single ref
4、ractive nucleolus. Its cytoplasm center was a little black and in granular. A total of 51 GV-stage eggs were obtained， which were (40.940±3.341) μm in diameter and (15.020±2.236) μm in core diameter， and the nucleus-plasma ratio was 0.054 ± 0.019. Conclusions： The extrusio
5、n method and DEPC-NS liquid can rapidly destruct the connection between the granulosa cells， in which the denuded GV-stage oocytes are easy to obtain. The nucleus-plasma ratio in the mice GV-stage oocytes is 0.054 ± 0.019， while is similar to other reports. It suggests that the nucleus-plasma
6、 ratio is an important indicator of oocyte maturation. KEY WORDSMouse;GV-stage oocytes;Extrusion method;Nucleus-plasma ratio 辅助生殖研究领域的一个重要内容是卵母细胞体外成熟(IVM)，通过提取生发泡(GV)期卵母细胞，模拟体内的成熟环境，在体外使卵母细胞达到最后成熟。GV期卵母细胞是卵原细胞成为初级卵母细胞之后，经细线期、偶线期、粗线期发育到双线期。在双线期后期，卵母细胞的核很大，染色质高度疏松，外包完整的核膜，此时的细胞核又称GV1。小鼠卵母细胞生长到卵泡腔形成时就已
7、完成，卵泡腔形成之前的卵母细胞处于GV期，此期卵母细胞的大小决定成熟卵母细胞的大小，卵母细胞的大小决定其恢复减数分裂和完成成熟的能力。本实验拟以小鼠为研究对象，获取其卵巢中GV期卵母细胞，并快速清除其上的颗粒细胞和透明带，为辅助生殖的研究提供方便快捷的GV期卵母细胞的裸卵。 1材料与方法 1.1材料 健康未孕雌性昆明小鼠20只，鼠龄78周，体重2030 g，均购自海南省人民医院动物实验室。自由饮食取水，维持光控时间为1212(光亮时间为618时，黑暗时间为186 时) 。 1.2主要仪器与试剂 微量移液器(法国Gilson公司，P10，P20，P200，P1000);Leica Mps 60
8、倒置显微镜(德国);体视显微镜;毛细玻璃管;一次性塑料培养皿;手术剪。试剂和溶液：DEPC-NS。 1.3获取GV期卵母细胞 (1)获得卵巢：用颈椎脱臼法处死小鼠，切开皮肤及腹膜，暴露腹腔器官，取出双侧卵巢，放入盛有DEPC-NS(注意液体量不能太多)的一次性塑料培养皿中，修剪卵巢周围组织并清洗备用。(2)将另一次性培养皿的背面用标注笔分为4等分，标上1至4,4个数字，在数字旁边分别滴上10μL DEPC-NS。(3)用带齿镊子挤压卵巢，释放卵母细胞，在2倍物镜体视显微镜的视野下，移动培养皿，将颜色淡的、轮廓明显、圆形、颗粒细胞少的卵母细胞用毛细玻璃管移动入含DEPC-NS的第1微滴中。
9、(4)用毛细玻璃管将第1滴中的卵母细胞分别转移入第2、3、4微滴中，捏放毛细玻璃管的吸头，清洗卵母细胞上的颗粒细胞，除去挤压卵巢时受损和转移时丢失的细胞，共收集到GV期卵母细胞51枚。(5)将校准玻片在倒置显微镜不同的倍数下摄像，作为长度单位以供参照。然后将以上步骤获得的GV期卵母细胞，在此倒置显微镜上摄像得到GV期卵母细胞图像。(6)应用Motic Images 2000 1.3软件对GV期卵母细胞的图像进行测量分析。 1.4统计学处理 采用SPSS11.5统计软件进行正态性检验：应用“Kolmogorov-Smirnov(柯尔莫哥洛夫-斯米尔洛夫检验)”单样本非参数
10、检验，检验水准α=0.05。 2结果 2.1获取的GV期卵母细胞 GV期卵母细胞，有一完整球形核，核膜明显，含有单个折光的核仁，胞浆中心稍变黑并呈颗粒状(图1)。图1小鼠卵巢中GV期卵母细胞 2.2小鼠GV期卵母细胞测量结果 细胞体积服从正态分布(Z=0.641，P=0.805)，核体积服从正态分布(Z=1.020，P=0.249)，细胞半径服从正态分布(Z=1.055，P=0.216)，核半径服从正态分布( Z=1.015，P=0.254)，计算体积、半径和核质比，结果见表1。表1GV期卵母细胞的核质比 3讨论 生殖工程技术常用的获取卵母细胞的方法是：在体视显微镜下用针筒抽取突出
11、卵巢表面的次级卵泡中的卵母细胞2。此方法要求的显微操作技能较高，短时间难以熟练掌握;再者，提取得到的卵母细胞上附着大量的颗粒细胞，还需应用透明质酸酶进行消化分解，导致成本增加。而本文使用的挤压法，只需摘下小鼠卵巢并挤压就可以将其中的卵母细胞释放出来，然后用毛细玻璃管收集即可得到;同时挤压卵巢、收集卵母细胞时所用的溶液生理盐水中添加DEPC(即成为了DEPC-NS)，就可以去除附着于卵母细胞上的绝大多数颗粒细胞。其原理是DEPC-NS是一种强氧化剂可以分解细胞连接，使得颗粒细胞之间以及颗粒细胞和卵母细胞之间的连接不复存在，这样再经过多次的转移清洗，就可以得到卵母细胞裸卵，此步骤不需使用透明质酸酶
12、去除颗粒细胞，这样既简单快捷又实惠。 本研究测得的GV期卵母细胞半径为37.59944.281 μm，与文献报道卵母细胞半径3050 μm相符合1。倪海儿等3报道东海鳓的初级卵母细胞早期核质比为0.180.19，中期为0.0380.045，晚期为0.0340.042。本文测得的核质比为0.054±0.019，其范围在东海鳓的初级卵母细胞早、中和晚期的核质比之间。提示核质比是卵母细胞发育成熟的重要指标，不同物种同时期的卵母细胞核质比在同一正常值，略有波动。张明凤4等研究发现隆线溞卵原细胞的核质比约为0.503，卵母细胞前期核质比约0.353，卵母细胞中期约为0.229，
13、后期核质比约0.200，成熟卵子核质比约0.179，不同物种核质比随着卵母的发育进程越来越小，在卵母细胞发育早期，细胞核的功能活跃，胞核增长较快，而细胞质增长相对较慢，越早期的核质比越大，随着卵母细胞的发育成熟，其细胞核发育速度逐渐慢于胞质的发育速度，核质比逐渐变小，最后在某一值稳定下来。在多种生物的胚胎中5， 核质比值的成倍增大是由某些基因定时开始转录决定的，小鼠2-细胞开始其核质比值成倍地增大， 因而认为新合成的染色质能感受卵内一些因子量的变化，胚胎细胞中染色质含量愈高，卵裂发生愈早，如果核内染色质为正常情况的2倍，卵裂将提前1个周期发生，所以受精后受母型调控的卵裂，将于核质比例达到一个新
14、平衡点而终止。说明核质比在胚胎发育中是一个重要指标，近一步探讨核质比基因调控机制，具有重要意义。 【参考文献】 1陈大元.受精生物学-受精机制与生殖工程M.北京：科学出版社，2000：146-164. 2庄广伦. 现代辅助生育技术M.北京：人民卫生出版社，2005：158-174. 3倪海儿，杜立勤.东海鳓卵巢发育的组织学观察J. 水产学报，2001,25(4)：317-322. 4张明凤，曾错，赵云龙.隆线溞孤雌溞生殖系统的组织学J.中国水产科学，2009,11(2)： 868-874. 5Pultz MA， Pitt JN， Alto NM.Extensive zygotic control of the anteroposterior axis in the wasp Nasonia vitripennisJ.Development， 2006,126(4)：701-710. 申明：本论文版权归原刊发杂志社所有，我们转载的目的是用于学术交流与讨论，仅供参考不构成任何学术建议。
