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1、核酸疫苗在动物疾病防治中的应用及其进展摘要：本文着重介绍核酸疫苗的研究状况，特别是猪瘟核酸疫苗的进展情况，以供大家的参考关键词：核酸疫苗核酸免疫随着畜牧业的发展，畜禽疾病的防治已愈来愈重要，尽管发达国家畜禽某些烈性传染病采取以消灭病原为主要的目的的捕杀措施，并收到了一定效果。但是，许多疾病还主要依赖疫苗作为预防手段。自从英国医生Jenner用牛痘苗预防天花并取得成功以来科学工作者又陆续研制了30余种减毒，灭活疫苗，被称为第一代疫苗。它们在人类及动物某些疾病防治中以挥了极其重要的俢。但减毒，灭活的潜在致病性和亚单位疫苗免疫反应的不完全性迫使人们继续寻找更为理想的免疫接种剂。于是，被称为第三代疫苗
2、的核酸疫苗就用而生，并逐渐显示出其内在的优越性。1.核酸疫苗的产生所谓核酸疫苗，即把外源性基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应。它不仅可诱导产生特异性抗体应答，更重要的是能诱生以特异性CTLS为代表的保护性细胞免疫应答，因此可能具有预防和治疗病毒感染的双重功效1。1990年Wolff等偶然发现给小鼠肌内注射外源性重组质粒后，质粒被摄取并表达所编码蛋白2。1991年Williams等发现外源基因输入体内的表达产物可诱导产生免疫应答3。Tang等将生长激素基因导入小鼠皮内，小鼠产生特异抗体，从而提
3、出了基因免疫的概念4。1993年Uimer等证实，小鼠肌内注射编码甲型流感病毒核蛋白的重组质粒后，可有效地保护小鼠抗相隔34年不同亚型的流感病毒的攻击5。从而核酸疫苗引起医学界的高度重视，并被认为是继减毒灭活疫苗和亚单位疫苗后的第三次疫苗革命。2.核酸疫苗的免疫机制核酸疫苗可以引发全面的免疫应答。当其导入宿主体内后，蛋白质被抗原提呈细胞（ACP），细胞内蛋白酶体复合物降解为810个氨基酸多肽，多肽被内质网腔上的抗原转运蛋白运送进入内质网，与MHC-I类分子形成聚合体，经高尔基体到达APC膜，被T细胞的受体识别，这是诱导CTL应答最有效的途径。近年来发现细菌DNA本身也是一种免疫佐剂，可有效地激
4、活免疫效应细胞。介导这一作用是一类具有特征性的短核甘酸序列，被称作免疫刺激DNA序列（Immmuno-stimulatory DNA sepuence,ISS）6。DNA疫苗的质粒在宿主细胞内的表达水平与调控DNA表达的高动子密切相关。不同高动子在不同机体组织中表达的水平可能显著不同，而这种差异又直接影响免疫应答的强度和时间。3.核酸疫苗在传染病防治研究中的应用近年来有关质粒DNA疫苗在人类及动物产生预防和治疗作用的研究报道不断增加，应用范围也逐渐扩大。如抗HIVDNA疫苗、抗流感DNA疫苗、抗狂犬病DNA疫苗、抗结核病DNA疫苗、抗疟疾DNA疫苗、抗乙型肝炎病毒DNA疫苗、抗丙型肝炎病毒DN
5、A疫苗、抗轮状病毒DNA疫苗、抗乳头瘤病毒DNA疫苗、抗单纯疱疹病毒DNA疫苗、抗囊虫病DNA疫苗、抗血吸虫DNA疫苗等都有相继报道7。4.猪瘟DNA疫苗的研究状况猪瘟病毒(CSFV或HCV)属于黄病毒科，瘟病毒属，为有囊膜的正链RNA病毒，由其引起的猪瘟是猪的一种急性接触性传染病，病程短，死亡率高；特别在亚洲、非洲、中南美洲仍然有猪瘟的发生。由于猪瘟传染性强，死亡率高又没有有效的弱毒或灭活疫苗来预防，在许多猪场经常用强毒苗来预防，虽然这种方法可以预防但也有可能造成猪瘟的大面积传染，所以好多国家禁止使用这种强毒疫苗，甚至发达国家常采用“检测加屠宰”的方法来消灭猪瘟，造成了大量的经济损失，以至于
6、开发一种免疫原性好的，且安全性高的抗猪瘟DNA疫苗就显的非常重要。随着人们对核酸疫苗的研究不断深入，近年来有关猪瘟DNA疫苗的研究也不断见报。4.1猪瘟病毒DNA序列及其抗原决定簇的研究猪瘟病毒DNA序列及其抗原决定簇的研究，能够为猪瘟DNA疫苗的研究提供个科学依据，特别在最近几年这方面的研究取得了突破性进展，像周鹏程、陈建国等用RTPCR方法扩增分别获得了中国猪瘟病毒强毒石门株和兔化弱毒株非结构蛋白NS3丝氨酸蛋白酶功能区即NS3（C）基因cDNA，将之克隆到pGEM T载体测定其核苷酸序列，并出其对应氨基酸序列，结果表明这两个毒株间的NS3（C）区基因核苷酸序列同源性为95.8%，氨基酸序
7、列同源性为99，有2个残基的差异；两毒株与一些猪瘟病毒以及同属的牛病毒性腹泻病病毒代表毒株的对应序列进行比较，所测核苷酸序列及的氨基酸序列均极为保守，而且氨基酸序列分析结果还表明，瘟病毒NS3（C）序列也含有与其它黄病毒同样保守的由His，Asp和Ser残基构成的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶催化三分体，三分体中Ser为丝氨酸蛋白酶催化活性关键氨基酸残基，将上述NS3（C）基因亚克隆至原核表达载体pET-28a中，并在E.coli中获得高效表达，将表达产物纯化并免疫小鼠，间接免疫荧光和Western blot结果表明制备了针对NS3（C）蛋白的多克隆抗体，上述实验结果为继续深入研究非结构蛋白NS3在猪
8、瘟病毒的复制及病毒与宿主细胞相互关系中的作用，提供了基础材料及参考数据8。马刚.李作生等(2002)报道：应用大肠杆菌表达的猪瘟病毒主要保护性E2抗原决定簇蛋白和全长E2基因构建的DNA疫苗免疫BALBc小鼠。取免疫小刀脾细胞与SP20骨髓瘤细胞进行融合，经克隆和间接ELISA筛选，获得了A11、B2、E3、H6、D5、D86株稳定分泌抗猪瘟病毒ED2蛋白单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞株。它们的腹水效价在1：8001：210000之间。抗体类型鉴定结果表明，A11、E3、H6、D5和D8为IgM类型，随后用蛋白A凝胶层析法和PEG沉淀法分别纯化了IgG和IgM单抗。对纯化单抗进行的抗原识别
9、表位研究结果初步表明，6株单抗可能识别3种不同的E2抗原表位9。 4.2抗猪瘟DNA疫苗的研究成果随着猪瘟病毒DNA序列及其抗原决定簇的研究的深入，人们用具有强免疫原性的基因整合到弱免疫原性能表达抗原决定簇的基因中来增强机体的免疫力。陈创夫 余兴龙等曾报道：应用DNA重组技术构建了猪瘟病毒E2基因与IL2基因的双表达真核表达载体，观察其表达水平，并对其免疫增强效果进行了观察，结果是构建了猪瘟病毒E2基因与白细胞介素2的真核表达质粒pIRST IL-2。将质粒转染BHK21细胞，可在体外表达E2和有生物活性IL2，pIRST IL-2质粒能诱导产生CSFV的特性免疫反应，pIRST IL-2所诱
10、导的免疫应答反应比使用单表达质粒pIRST强，实验表明，IL2与猪瘟病毒E2基因构建的双表达基因疫苗能有效提高基因疫苗的免疫效果10。韩雪清 张涌等将猪瘟病毒的E2基因克隆入酵母分泌型表达载体pPIC9K中，酶切线性化后电穿孔导入Pichia pastoris进行整合，经G418筛选得到高拷贝转化子，甲醇诱导表达。SDSPAGE和Western blit结果证实了酵母培养上清液中含有E2蛋白。免疫活性研究证明P.pastoris表达的E2蛋白能刺激动物产生抗猪瘟病毒的抗体11。5.核酸疫苗的优缺点与传统的疫苗相比，DNA疫苗有以下优点：诱导机体产生全面的免疫应答且诱导期长，甚至终身免疫；没有减
11、毒活疫苗可能在体内返强后致病的危险；对不同亚型的病原体有交叉抵抗作用；与亚单位疫苗有同样的高产性；可将码不同抗原的基因构建在同一个质粒中，或将不同抗原基因的多种重组质粒联合应用，制备多价核酸疫苗；核酸疫苗既有预防作用又有治疗作用；7质量易于控制和评价，DNA序列清楚，纯化技术简便，可免除污染。虽然DNA疫苗可能会给某些疾病防治带来一场根体性的变革。然而，还有许多急待解决的问题及一些不足之处：质粒的转归问题肌肉注射质粒后，质粒去向如何尚待进一步研究；质粒的长期过度表达质粒接种后少量蛋白，长期过高水平表达，能否导致机体对该抗原的免疫耐受或麻痹有待进一步研究。6核酸疫苗展望核酸疫苗的研究具有深远意义
12、。可用于细菌、病毒、寄生虫等多种疾病的防治，其多价、高效、廉价等优点使其潜在的应用价值不可估量。可能对人类疾病的防治以及畜牧业的健康发展起到划时代的作用。它将是21世纪人类和动物与各种疾病抗争的有利开武器参考文献：1. 冯志华等.Th1类细胞因子对这PHCVC重组体诱生免疫应答的增强作用.中国病毒学.2001.（16）2.1011042. Wolff JA,Malone RW,Willams P et al.Science,1990,247:1465.3. Williams RS,Johnston SA,Riedy M,et al.Introductionof foreign genes in
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14、疫苗在动物疾病防治中的应用及其进展.畜牧兽医科技信息.2002.（4）.2:17188. 周鹏程 陈建国等. 猪瘟病毒NS3丝氨酸蛋白酶功能区基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达. 畜牧兽医学报.2001,32(4).-330-3379. 马刚 李作生等. 猪瘟病毒保护性抗原E2蛋白单抗的制备及其抗原表位的初步分析. 中国兽医学报.2002.22(2).-121-12410. 陈创夫 余兴龙等. L2与猪瘟病毒E2基因真核双表达载体的构建及其免疫增强作用的研究. 石河子大学学报.2001,5(2).-90-9411.韩雪清 张涌等.猪瘟病毒E2基因在Pichia pastroris中的表达及其免疫活性的初步研究. 生物工程学报.2002,18(2).-208-211
