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1、教 学 单 元 教 案课程 仪器分析 任课教师 张诺 201 2 年 上 学期授课题目电泳技术和常用电泳仪（二）授课类型及时数理论课： 2 学时实践课： 学时理实一体化： 学时授课班级11检验301.302班执行时间 3月 27 日 月 日教学目标了解电泳技术的分类；电泳仪临床应用实例；熟悉电泳方法简介；掌握毛细管电泳分离模式；与毛细管电泳相关的基本概念；电泳技术的质量控制。教学重点与难点重点：毛细管电泳的特点；影响电泳的外界因素。难点：电泳技术的质量控制。教学方法和手段多媒体教学参考资料陶义训，吴文俊主编 现代医学检验仪器 上海科学技术出版社，2002陶义训主编 现代检验仪器导论 上海科学技
2、术出版社，2002曾照芳主编 临床检验仪器学 第2版 人民卫生出版社，2005朱根娣主编 临床常用检验仪器原理、构造、维护 上海科学技术文献出版社，2002其他教 学 单 元 教 案教学内容及过程旁 批教学引入：电泳是指带电荷的溶质或粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。利用电泳现象将多组分物质分离、分析的技术叫做电泳技术。教学内容：5毛细管电泳的基本结构和分离模式5.1 与毛细管电泳相关的基本概念 电场强度、 电泳淌度、迁移时间、电泳速度、电渗流、焦耳热。5.2基本工作原理溶液中的带电粒子以高压电场为驱动力，沿毛细管通道，以不同速度向与其所带电荷相反的电极方向迁移，并依据样品
3、中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离。5.3毛细管电泳的特点高灵敏度、高速度、高分辨率、样品少、易自动化、应用范围广。5.4毛细管电泳分离模式毛细管电泳有多种分离模式，如毛细管区带电泳、毛细管胶束电动色谱、毛细管凝胶电泳、等电聚焦毛细管电泳、毛细管等速电泳和毛细管电色谱等。毛细管区带电泳毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis，CZE)也称为毛细管自由溶液区带电泳，根据组分的迁移时间进行定性，根据电泳峰的峰面积或峰高进行定量分析。它适用于小离子、小分子、肽类、蛋白质的分离，在一定限度内适合于DNA的分离。应用CZE分离人血清中氨甲喋呤（MTX）及其代
4、谢产物7羟基氨甲喋呤（7OHMTX）。毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳是将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。适用于分离、测定肽类、蛋白质、DNA类物质的分离。CGE正在向第二代DNA序列测定仪发展，并将在人类基因组计划中起重要作用。毛细管胶束电动色谱毛细管胶束电动色谱又称微团电动毛细管层析，该技术的最大特点是使毛细管电泳有可能在用于离子型化合物分离的同时进行中性物质的分离，加强了毛细管电泳的选择项，弥补了中性分子分离方向的不足。因此在各个领域特别是生物药物领域显示了广泛的应用前景。毛细管等电聚焦电泳毛细管等电聚焦电泳是在电场作用下，带电的分子会在电解质中作定向的迁移，毛细管的等电聚焦是在毛
5、细管内实现的等电聚焦过程，具有极高的分辨率，通常可以分离等电点差异小于 0.01pH单位的两种蛋白质，例如肽类、蛋白质的分离。毛细管等速电泳毛细管等速电泳是一种较早采用的模式，是电泳中唯一的分离组分与电解质一起向前移动的同时进行分离的电泳方法。常用于分离小离子、小分子、肽类及蛋白质。毛细管电色谱毛细管电色谱它包含了电泳和色谱两种机制，是在毛细管中填充或在毛细管壁上键合（或涂壁）固定相，从而构成毛细管色谱柱，依靠电渗流推动流动相，携带样品迁移，根据样品分子的质荷比、分子尺寸及分配系数的差别而分离。它与色谱法的不同在于，流动相通道色谱柱的推动力是电场力，而不是压力。它与区带毛细管电泳法的区别是具有
6、电泳与色谱二种作用力，因此适用范围更广泛。5.5毛细管电泳仪的基本结构毛细管电泳仪的结构并不复杂，主要有高压源、毛细管柱、检测器，以及两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液槽。输出讯号和记录装置相连，记录装置可以是一个普通的记录仪、积分仪，也可以是有控制功能的计算机工作站。图6-4是毛细管电泳仪装置示意图。毛细管电泳仪装置示意图毛细管柱毛细管是毛细管电泳仪的核心部件，毛细管电泳的分离过程主要在毛细管内完成。毛细管柱通常都是圆管型的，理想的毛细管柱应是化学和电惰性的，紫外和可见光可以透过，易于弯曲，有一定的柔性，耐用而且便宜。检测器毛细管电泳法的进样技术5.6常用各种电泳仪简介稳压稳流电泳
7、仪、全自动乙纤膜电泳仪、全自动荧光/可见光双系统电泳仪、全自动琼脂糖电泳仪、双向电泳及双向电泳-液相色谱-质谱联用、高效毛细管电泳及高效毛细管电泳-质谱联用、毛细管电泳芯片、DNA测序系统6电泳仪临床应用6.1血清蛋白电泳血清中的蛋白质构成了血清溶解物的绝大部分，其中有载体蛋白质、抗体、酶、酶抑制剂、凝血因子。新鲜血清经乙酸纤维薄膜或琼脂糖电泳、染色后，通常可见5条带，即清蛋白、a1、a2、b和g球蛋白。6.2 尿蛋白电泳临床进行尿蛋白电泳的主要目的是：确定尿蛋白的来源；了解肾脏病变的严重程度（选择性蛋白尿与非选择性蛋白尿），从而有助于诊断和预后的判断。6.3血红蛋白及糖化血红蛋白电泳应用电泳
8、法鉴别患者血液中Hb的类型及含量，对于贫血类型的临床诊断及治疗具有重大意义。6.4免疫固定电泳可对各类Ig及其轻链进行分型，最常用于临床常规M蛋白的分型与鉴定。6.5 同工酶电泳6.6脂蛋白电泳脂蛋白电泳检测各种脂蛋白（包括胆固醇和甘油三酯）主要用于高脂血症的分型、冠心病危险性估计，以及动脉粥样硬化性及相关疾病的发生、发展、诊断和治疗（包括治疗性生活方式改变、饮食及调脂药物治疗）效果观察的研究等。7电泳技术的质量控制7.1 电泳分析前的质量控制电泳分析前的质量控制是指电泳操作前所可能存在或出现的误差以致影响电泳的结果，包括选择标本采集、标本保存、电泳方法、电泳试剂保存等。7.2电泳分析中的质量
9、控制7.3电泳分析后的质量控制三、电泳技术新进展一、电泳技术与免疫技术相结合，大大扩大了其临床应用的范围让电流来加速抗原与抗体的扩散并规定其运行方向、从而加快了沉淀反应速度。免疫电泳技术的种类很多，如：对流免疫电泳（CIEP）、火箭免疫电泳（RIE）、电免疫扩散（EID）。该技术的最大优势是敏感性达50-150mg/dl，操作周期短，分辨率高，结果易于分析。现最常用于M蛋白的分型与鉴定，已列入临床实验室的常规检测工。二、电泳技术进行同工酶谱分析，提高诊断率1血清乳酸脱氢酶同工酶（ISO -LDH）：测定LDH同工酶有电泳法、离子交换柱层析法、免疫法、抑制剂法和酶切法，但迄今用得取多的仍是琼脂糖
10、凝胶电泳法。经电泳分离后要分离出五种同工酶区带，急性心肌梗塞发病后平均6h LDH1即开始升高，LDH1/LDH21为心肌损伤的阳性决定性水平，肝癌时可见LDH5明显升高，各区带含量的确定，将经电泳分离后的同工酶谱采用扫描予以定量，其精确度明显高于用肉眼判断。 2血清肌酸激酶同工酶（ISO-CK）；测定CK和CK-MB仍是目前用于证实急性心肌梗塞的首选指标。近年来国内一些单位用免疫抑制法测CK-MB，使用电泳方法分离CK-MB，是根据CK-同工酶分子结构不同，在电泳缓冲液中，所带电荷各异，可以从阴极到阳极将CK不同组份予以分离，其分别为CK-MM，CK-MB和CK-BB。电泳特点是当出现异常同
11、工酶如巨CK、巨CK等，从电泳图谱上很容易发现，由扫描仪对各条酶进行扫描，报告各条区带所占百分比，结合总酶活力，求得区带的酶活力定值结果。Macro-CK在CK-MM和CK-MB中间，而CK-MT位置靠近阴极端，在CK-MM后面。这样不会将CK-BB和各种异常同工酶误认为是CK-MB而误诊，也可解决CK-MB假性增高的错误原因所在。为此，CK同工酶电泳是项非常实用的检验技术，具有十分重要的临床意义。 3CK亚型同工酶：此外，CK-MB和CK-MM亚型测定常采用琼脂糖凝胶等电聚焦电泳或高压电泳，由于操作比一般电泳麻烦，故常规常测定尚无法普及。目前引进的自动电泳仪，有试剂盒提供，可作CK亚型分析，
12、参考值：CK-MM1（57.74.7）%;CK-MM2为(26.55.3);CK-MM3为(15.82.5)%;CK-MM3/CK-MM1比值为0.280.05(范围0.15-0.39),阳性决定性水平0.5。AMI第一天血中以MM3为主，但第二天以后则以MM1为主。采用电泳法分离CKMB，CKMB1和CKMB2在正常人血中CK-MB2极微，一般比值近似1，在急性心肌梗塞后4-6h CKMB2亚型即在血循环中可被检测到，故MB2/MB1的比例明显升高，并早于总CK-MB片段的增高。当心肌梗塞缓解后此比值也逐渐下降。也可用于溶栓治疗后的病情观察。三、结合酶免疫标记抗体技术，检测脑脊液内寡克隆区带
13、 曾有作者报道采用二维电泳和银染进行CSF蛋白质的分离与鉴定，方法繁复，耗时，现采用高分辨率琼脂糖凝胶电泳分离CSF中的蛋白质，并经抗原和辣根过氧化物酶标记的特异性IgG抗体进行反应来鉴定“寡克隆区带”（OCB），经此酶免疫标记放大技术和显色步骤，蛋白质浓度达31-125ul/L即可予以检测，可使检测灵敏度提高了100倍，这样脑脊液无须浓缩，避免了在浓缩过程中蛋白质的丢失。可用于证实和分辨OCB免疫球蛋白及其型别。若在脑脊液标本中检出OCB，而其相应标本中未能检出区带，则为阳性，真实地反映是由中枢神经系统本身合成的免疫球蛋白，具有重要临床意义。它是一种定性检测，在多发性硬化症时，OCB是一个十
14、分重要的标志物。但须将患者血清和CSF在同一天同步进行分析，以认证不同来源的免疫球蛋白。中枢合成免疫球蛋白是中枢神经系统疾患的一个重要信号，主要用于诊断和鉴别诊断中枢神经系统疾患如：多发性硬化症、痴呆、脊髓炎、神经性梅素等。四、利用固相内抗原、抗体反应分离脂蛋白（a），用于心、脑血管独立的危险因子的检测 该该技术是利用抗原、抗体反应将电泳分离的脂蛋白予以鉴别。血清经琼脂糖凝胶电泳，再经染色后可出现不同脂蛋白的条带。由于凝胶中脂蛋白等电点不同，不仅可区分a、前和区带，又因介质中含有抗脂蛋白（a）LP（a）抗体及阳离子存在，抗LP（a）与患者血清中LP（a）结合形成复合物，阳离子则抑制其他脂蛋白的
15、泳动速度，LP（a）便与其他脂蛋白分离开来，使分辨十分清晰的LP（a）条带呈现在前与区域之间，将阳性条带扫描后，可获得区带的面积及其百分含量，该方法使电泳技术趋于完美，大大减少了手工操作的弊端，既可予以半定量，又能将胶片保存，便于比较。提高对心、脑血管独立的危险因子-LP（a）检测的敏感性和特异性。五、按分子量大小进行非浓缩尿蛋白电泳，区分尿蛋白类型 尿蛋白电泳可将尿液中各种蛋白质分离用于区分尿蛋白类型，可在无损伤的情况下，协助临床判断肾脏损伤的部位。国内部分实验室采用SDS-PAGE盘状电泳进行尿蛋白分离，该法具有局限性，耗时，操作繁琐，标本要求高，尿液需预浓缩，不适于临床实验室广泛开展。SDS-AGE电泳不需预浓缩，尿蛋白电泳后呈现出中、高分子量蛋白区，带主要反应肾小球病变；呈现出低分子量蛋白区带，可见于肾小管病变及溢出性蛋白尿；混合性蛋白尿则可见到大、中、小各种分子量区带，示肾小球及肾小管均受累及。扫描仪可对电泳后尿液中蛋白质剖象进行扫描，求出百分比，以显示肾小球或肾小管损伤程度，其电
