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1、结核分枝杆菌与实验室生物安全广东省结核病防治研究所钟球 钱明附件广东省结核病防治研究所钟球 钱明 结核病的定义 结核病的疫情 结核病病原学 结核病的流行 结核病实验室生物安全 结核病实验室安全防护 结核病实验室废物处理 结核病职业暴露 结核病是由结核分枝杆菌（偶尔可由牛型或非洲型分枝杆菌）引起的一种细菌性疾病。结核病可累及全身各个器官，但以肺结核最为常见。该病具有传染性强，散播面广，不分地域均可发生。结核病可由呼吸道、消化道、皮肤等途径感染，但其主要传播途径是以空气为传播因子的呼吸道传染，而排菌的肺结核病人传染性更大，是传播感染的主要传染源。结核病的疫情n 感染人数 约为20亿n 新发活动性肺
2、结核病人 890万(141/10万)n 新发涂阳肺结核病人 390万 n 结核病发病率每年增加1%n 估计患病人数为1550万例（患病率为246/10万）其中包括HIV+TB38万例n 死于结核病为180万例，结核病死亡率为29/10万,其中包括HIV+TB死亡27万例 结核病病原学 结核分枝杆菌是引起人类结核病的主要病原体。1882年由德国医生Koch发现。在微生物分类中，结核分枝杆菌属于厚壁门、裂殖菌纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝杆菌属。分枝杆菌复合群共包括人型、牛型、非洲型和田鼠型，而人型结核分枝杆菌是人类主要的致病菌。结核分枝杆菌的形态 结核分枝杆菌菌体具有多形态特征，除正常典型形态外
3、，受不良生长条件的影响。如物理因素、化学因素，特别是药物因素，而呈现异常变化，其各种形态可归纳为杆菌型（基本形态）、滤过型、颗粒型和球菌型（L型）4种类型。 1. 杆菌型（基本形态）结核分枝杆菌正常典型的形态是直或稍弯曲、两端钝圆的杆菌。菌体 长14m，宽0.30.6m，无芽胞、无荚膜、无鞭毛，生长发育期间有分枝生长倾向。 2. 滤过型 早在1901年，Foutes在检查细菌滤器滤过的结核分枝杆菌培养滤液时，在电子显微镜下观察到球状微粒体。1991年，Khomeko在豚鼠损坏性肺结核模型中证实了滤过型的存在。此球状微粒体可通过细菌滤膜，称为滤过型 。 3. 颗粒型 1907年莫赫(Much)在
4、结核性冷性脓肿、浆液性渗出液、干酪性淋巴结等脓液中观察到革兰染色阳性颗粒，称为莫赫颗粒。莫赫颗粒的重要意义在于这些颗粒型体仍有生机与活力，在适宜的营养条件下，可重新获得增殖，发育生长出典型结核分枝杆菌。 4. 球菌型（L型） 结核分枝杆菌在体内外受物理、化学、免疫等因素的影响，维持菌体固有形态的细胞壁缺损或丧失，产生细胞壁缺陷型。细胞壁缺陷型细菌是1935年Kilienberger在英国Lister医学研究院研究念珠状链杆菌时首先发现的，故以Lister医学研究院的第一个字母，将细胞壁缺陷型细菌命名为L型菌。结核分枝杆菌的染色特性 结核分枝杆菌本身无颜色，观察结核分枝杆菌必须染色后进行。结核分
5、枝杆菌革兰染色阳性，但革兰染色不易着色。经苯胺染料着色后，能抵抗酸和酸乙醇脱色，此种特性称为抗酸性。Z-N染色法为最常用的一种抗酸染色方法，经此法染色后，分枝杆菌，包括结核分枝杆菌呈红色，而标本中其他细菌、细胞、杂质等均呈蓝色结核分枝杆菌的生长特性 结核分枝杆菌生长缓慢，繁殖一代在人工培养基内约需要1520小时，在静脉感染未经免疫小鼠肺中约需要15小时，在巨噬细胞内约需要1520小时，在家兔角膜中约需要2022小时。结核分枝杆菌的抵抗力 结核分枝杆菌因细胞壁含大量类脂质，尤其是腊样物质，具有疏水性，对物理和化学因素的作用均较一般致病菌抵抗力强。 1. 物理因素影响 结核分枝杆菌生存能力较强，在
6、温室和阴暗处干燥痰内可以存活68个月，粘附在飞扬的空气尘埃中可保持传染性810天。结核分枝杆菌一般较耐低温，在-68能存活45年。 干热对结核分枝杆菌杀伤力弱，痰内结核分枝杆菌在100下需要45小时被杀灭。湿热对结核分枝杆菌杀伤力强，在6030分钟、7010分钟、805分钟和901分钟可将其杀死，因此煮沸与高压蒸气消毒是最有效的方法之一。 结核分枝杆菌对光线和射线敏感，在太阳光直射下27小时死亡。病人用过的物品在强阳光下直晒半日，基本可达到消毒的目的。101mg/ml菌悬液，液层厚度3mm，用10W紫外线灯在距离确 0.5m处持续照射3分钟，在距离1m处持续照射 10分钟，经培养无细菌生长。但
7、紫外线穿透力弱，难以透入固体物质内部和液体深层，因此紫外线通常用于空气和物体表面消毒。 2. 化学因素的影响 化学消毒剂的种类很多，其杀菌的机制因化学药物种类不同而异。乙醇使菌细胞蛋白质变性、凝固而产生杀菌作用。结核分枝杆菌直接接触70%75%乙醇530分钟可被杀死，因此可用于皮肤消毒。但由于乙醇能凝固蛋白，使痰表面形成一层把菌体包裹起来的膜，短时间内不能杀死细菌，故乙醇不能用于痰的消毒。 苯酚主要通过破坏菌细胞膜而致细胞质内容物漏出，使菌体蛋白质变性、凝固，抑制菌体脱氢酶和氧化酶等酶系统杀死结核分枝杆菌。2%苯酚5分钟、5%苯酚1分钟能杀死结核分枝杆菌培养物。5%苯酚与痰液等量混合，24小时
8、才能杀死结核分枝杆菌。煤酚皂溶液作用机制与苯酚相似，0.5%煤酚皂60分钟，1%煤酚皂45分钟，2%煤酚皂10分钟，5%煤酚皂5分钟，即能杀死结核分枝杆菌培养物。5%10%煤酚皂等量混入痰标本，12小时可杀灭结核分枝杆菌。 甲醛使菌细胞蛋白质变性凝固，丧失代谢功能致细菌死亡。1%甲醛处理结核分枝杆菌5分钟，可使细菌死亡。5%甲醛和痰液等量混合，处理12小时以上才能达到杀菌作用。 “84”消毒液是以氯为主要成分的消毒剂。氯是一种氧化剂，能使菌体的酶失活，还能与蛋白质的氨基结合，使菌体蛋白氯化，代谢功能障碍，细菌死亡。0.5%“84”消毒液15分钟可杀死结核分枝杆菌培养物，但对在蛋白质混合液中的结
9、核分枝杆菌几乎无消毒效果。 结核分枝杆菌对酸、碱抵抗力强，在4%NaOH，3%HCL和6%H2SO4中30分钟仍能存活。临床应用酸或碱加入病人标本，消化蛋白质及杀灭杂菌，以此分离出结核分枝杆菌。结核分枝杆菌对染料，如113000孔雀绿和175000甲紫有抵抗力，通常在培养基内加入一定量的孔雀绿或甲紫抑制其他杂菌生长。对普通细菌有较强杀菌作用的新洁尔灭，对结核分枝杆菌几乎无消毒作用。 结核分枝杆菌的致病性 结核分枝杆菌不产生内、外毒素，也无侵袭性酶类。一般认为其致病作用可能与菌体表面结构及某些菌体成分，如脂质、某些菌体蛋白、多糖等多种物质有关，主要是有毒结核分枝杆菌菌株在易感机体内顽强增殖和与机
10、体相互作用的结果。结核病流行 结核病在人群中流行的三个生物学环节是： 1、传染源， 2、感染传播途径； 3、易感人群。影响结核分枝杆菌传播的主要因素 1、排菌量痰中结核分枝杆菌越多，传播的危险性越大。病人出现痰涂片阳性若1ml痰液中含菌量为1 00010 000，其痰涂片阳性率为 40%50%，痰液中含菌量低时，痰涂片阳性率亦低（表l）。 表1痰涂片与痰标本中结核分枝杆菌数 痰涂片阳性（涂阳）病人的排菌量大，其密切接触者的结核感染率明显高于痰涂片阴性（涂阴）病人的密切接触者，英国报告涂阴培阴病人的家庭儿童密切接触者结核感染率为17.6%；涂阴培阳病人的接触者结核感染率为26.8%；涂阳培阳病人
11、的接触者结核感染率高达65.0%（表2）。 表 2不同传染源对 15岁以下密切接触者的感染率（%） 2排出飞沫的大小传染源排出的飞沫受压力和粘稠度的影响而大小不一，飞沬核直径110m者在空气中漂浮时间长，可进入人体末梢支气管内；飞沫核直径较大者，则受地心引力的影响而坠落。 3患者病变与症状病变广泛、损害严重的患者，尤其是病变急剧进展，干酪溶解形成空洞患者的痰中含有大量结核分枝杆菌，是主要的传染源。患者咳嗽、喷嚏或大声说话时都能产生飞沫，有报道，当人咳嗽时每次排出的飞沫数约为3500个，一次喷嚏则可排出飞沫达100万个；平常说话5分钟所排出的飞沫数相当于一次咳嗽，咳嗽是肺结核病人产生飞沫的主要方
12、式。 表3记录了病人每晚咳嗽次数，并观察其014岁家庭接触者的结核感染率每晚咳嗽48次以上患者的家庭接触者感染率为43.9%，而咳嗽12次以下患者的接触者感染率为27.5 %。 表3传染源咳嗽次数与接触者感染率 4接触的密切程度周围人群与传染源接触越密切，受感染的机会越多，涂片阳性病人的密切接触者感染率明显高于偶尔接触者（表4）。 表4不同接触程度儿童感染率 5环境因素与传染源病人同处于空气不流通的室内的密切接触者，受结核感染的可能性增大。第二次世界大战时期曾报道潜艇内官兵大批感染和发病，也有民航客机上结核病传染源使同机乘客受感染的报道。传播途径 呼吸道感染（respirator tract
13、infection）是肺结核的主要传染途径（routes of infection），飞沬传染（droplet infection）为最常见的方式。传染源主要是排菌的肺结核患者（尤其是痰涂片阳性未经治疗者）。飞沬核（droplet nuclei） 10m时可被吸人呼吸道，健康人可因吸入患者咳嗽、打喷嚏时喷出的带菌飞沫而受感染。 易感者 结核分枝杆菌进人人体，引起易感者（susceptible）机体的复杂反应。 1人体的防御反应人体的防御反应（defense reaction）有物理、化学和生物学反应。进人呼吸道的结核分枝杆菌飞泳核可被鼻、咽、喉、气管和支气管的粘液吸着、被酶杀灭并随纤毛运动经咳
14、嗽、喷嚏和咳痰等动作排出体外，或被吞噬细胞吞噬杀灭。当防御功能（defense function）低下时，结核分枝杆菌进人下呼吸道，引起机体反应。 2人体的易感性未受结核感染的人是结核病的易感人群（susceptible population）一旦受到结核分枝杆菌传播，具有普遍的易感性（susceptibility），进入人体的结核分枝杆菌可在人体内繁殖，结核分枝杆菌的繁殖周期约为1020小时，一条结核分枝杆菌在体内繁殖1周可达128条菌，繁殖20天将超过100万条菌（表5），体内的大量结核分枝杆菌将使人体患病，引起机体的免疫与变态反应。 表5一条结核分枝杆菌在体内的繁殖情况 3.免疫与变态反
15、应人体对结核分枝杆菌的自然免疫力（natural immunity）（先天免疫力）是非特异性的。接种卡介苗（bacilli calmette gurin，BCG）或受结核分枝杆菌感染后所产生的获得免疫力（acquired immunity）（后天性免疫力）则具有特异性，能将入侵的结核分枝杆菌杀死或严密包围，制止其扩散，使病灶愈合。结核病的免疫主要是细胞免疫，表现为淋巴细胞的致敏与吞噬细胞功能的增强。化疗时代的结核病流行 化学疗法的流行病学效果 传染性肺结核病人接受抗结核药物化学治疗（chemotherapy）后，肺部病灶中的结核分枝杆菌被杀灭，传染性减小以至消失，传染源的流行病学作用随之消失。实验报告敏感菌在未治疗时相对传染性 100%，在治疗中只有25%，耐药病人未治疗时相对传染性为 100%。在治疗时则只有27.3%。
