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1、细胞凋亡小泡与CD8 T细胞的交联,及对肺结核防预摘要CD8 T淋巴细胞在对抗结核分枝杆菌的预防免疫中起到重要的作用。最近,我们描述了一条在肺结核中CD8T细胞活化的迂回途径，该途径通过来自被感染细胞的细胞凋亡小泡调节，将分枝杆菌性抗原运输到树突细胞(DCs)。这里我们证实在体内，来自分支杆菌感染的巨噬细胞的凋亡小泡,刺激CD8 T细胞。DCs来消耗淋巴结的自导严格要求有效的交联。经核内体内为主的蛋白酶体处理发现在受体DCs中小泡-相关抗原随后死亡。此外，囊泡加工取决于脂结合蛋白得存在来使凋亡膜解体。通过Toll-样受体（TLR）刺激，凋亡小囊泡显示有效的辅助活性。最后，从受感染的细胞接种囊性
2、小泡诱导防预多发性结核感染。综上所诉,我们提出这个迂回路径来代表调节 CD8 T细胞在体内的交联及对肺结核的防预的一个真正的免疫学机制。介绍肺结核是最常见的全世界性细菌感染疾病。免疫对抗它的病原学作用者，结核分枝杆菌，主要涉及CD4 T细胞。然而,CD8 T细胞在保护预防结核病起着至关重要的作用,因为缺乏CD8 T细胞造成对分枝杆菌的攻击更高的易感性。分枝杆菌性肺结核主要感染肺部的巨噬细胞。感染后，分枝杆菌定居在早期吞噬小体内并通过抑制吞噬小体成熟及抑制与溶酶体融合而逃避免疫系统。此外,分枝杆菌抗原在吞噬小体内被隔离,不能穿越进入胞浆。由于CD8 T细胞识别源于细胞质的抗原并使抗原沿MHC-I
3、抗原-表达路径被处理,关键问题一直是CD8 T细胞如何遇到各自分枝杆菌性抗原表位。先前的工作描述在结核病中CD8 T细胞的活化这条迂回途径来克服这一障碍。因此,分枝杆菌诱导被感染的巨噬细胞的细胞凋亡，随后释放含自分枝杆菌抗原的凋亡小泡。这些小泡被DCs吞没，加工处理抗原物为后续提供给CD8 T细胞。因此,这条迂回路径代表了 CD8 T细胞通过吞噬小体-封闭的抗原活化的专用机制。最初,在病毒性感染中发现细胞凋亡和T细胞的活化的关系，病毒性感染中将死的被感染细胞通过共培养的DCs促进CD8 T细胞启动。这一机制涉及从含有抗原供体细胞到受体细胞的转移,最终调节抗原呈递,这一机制被称之为与T细胞的活化
4、相关的交叉呈递或交联。这条迂回路径包括经典交联,后者被证实为多种肿瘤和感染模式。几种病原体包括沙门氏菌和志贺氏菌诱导感染宿主细胞的细胞凋亡。然而,凋亡小泡作为交联剂,还不能确定在这些模型系统中。不同的模式可以解释交联的机理。最新数据显示,抗原呈递细胞(APC)的吞噬小体配备完整的分子装置,要求MHC-I限制性抗原呈递包括抗原呈递相关的转运（TAP）,肽加载复杂,及邻近的蛋白酶体。这表明吞噬小体组成一种自主细胞器，通过主要细胞便利直接的交叉呈递。然而,新的研究不能证实这些结论。因为这条迂回路径是在人类的体外系统中发现,就炎症性过程而言，交联 CD8 T细胞仅仅能代表旁观者通过周围DCs接受，凋亡
5、小泡的活化。研究凋亡小泡路径是否反映了真正的免疫学机制，即在周围组织中通过DCs小泡的跨越摄取，随后移动至耗竭的淋巴结,并且在淋巴组织启动T细胞，我们建立了抗原特异性体内模型。为此,我们使用重组分枝杆菌卡介苗（BCG-OVA）来感染的巨噬细胞。由于宿主细胞固有侵染诱导的凋亡的抑制，我们认为通过被感染的APCs细胞死亡后囊泡形成的外在控制作为最可靠的方法。我们通过来自被感染巨噬细胞的细胞凋亡小泡使小鼠免疫，并采纳性地转移OVA特异性TCR-转基因CD8 T细胞到受体细胞,继而分析CD8 T细胞体内活性。结果分枝杆菌诱导凋亡小泡巨噬细胞感染后，分枝杆菌引起宿主细胞调控的细胞死亡。为了将细胞凋亡形象
6、化，用重组BCG-OVA感染后，我们进行了鼠科的巨噬细胞的Annexin V染色。它将Annexin V 绑定于磷脂酰丝氨酸典型地暴露在凋亡膜的外部小叶。图1A揭示BCG-OVA-感染的巨噬细胞的Annexin V染色的红色荧光,标志细胞凋亡相较于非感染细胞。包括星孢菌素在内，作为凋亡细胞死亡的调控,激活半胱天冬酶-3以及随后的细胞凋亡级联。扫描电镜(SEM)显示了经历了侵染诱导的细胞凋亡的巨噬细胞的囊泡形成(图1B)。值得一提的是,垂死的巨噬细胞通过出芽于细胞索的细胞凋亡小泡表现出一系列显型(图1B,中部)。巨噬细胞的不同超速离心法导致同源的囊泡制备如同SEM指示(图1B,底部)。为检测重组
7、BCG(卡介苗)替代的抗原使否存在于凋亡小泡中,我们通过单克隆抗体对抗卵白蛋白进行了囊泡蛋白质的蛋白印迹。卡介苗表达相当于卵细胞碎片(氨基酸230-359)的w12 kDa带,这些带在来自未感染的巨噬细胞得凋亡小泡中不存在(图1C)。综上所诉,凋亡小泡的产生包括来自BCG-OVA-感染的巨噬细胞的替代抗原证明是完全具有功能的。通过凋亡小泡的CD8 T细胞的交联为了研究在体内凋亡小泡是否激活天然CD8 T细胞,我们通过皮下给于来自未感染或天然巨噬细胞得囊泡制剂使野生小鼠免疫。相平行的,我们从TCR-转基因动物(OT-1)具体为OVA决定素SIINFEKL中分离出CD8 T细胞。随后,在过继转移到
8、接受免疫的小鼠前，我们用荧光染料羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）标记OT-1细胞。这种染料随着细胞分裂同样分离,使得增殖模式产生。转移后三天，淋巴细胞从耗竭的淋巴结制备并为CD8染色。流式细胞仪分析揭示，转移的CD8 T细胞通过来自CFSE稀释法标记的受感染细胞的囊泡刺激大量活化表明(图2A,上右)。相反,受体动物通过来自未感染的巨噬细胞的凋亡细胞小泡或来自野生型BCG感染的细胞（不表达OVA）的囊泡进行免疫，得到的CD8 T细胞并没有增殖(图2A左上,数据未显示)。此外,细胞内细胞因子染色显示，通过来自未感染细胞的囊泡的刺激后，相对于OT-1细胞，CD8 T细胞随着分裂产生了大量的
9、干扰素-g(IFN-g)，(图2A,底部)。接下来,我们通过关注T细胞的活化检查与凋亡小泡相关的抗原呈递分子的作用。为了这个目的,我们通过感染的巨噬细胞小泡缺乏b2 微球蛋白(b2m)产生了缺乏MHC-I分子的囊泡。相对于通过由感染细胞派生的囊泡的刺激，通过来自感染的b2m-KO巨噬细胞的凋亡小泡免疫诱导体内固有CD8 T细胞活化，(图2B)。凋亡小泡产生于受刺激的野生型细胞目的为刺激b2m-缺陷动物转基因OT-1细胞引发适度的CD8 T细胞应答(图2C,上)。然而,对细胞增殖程度观察表明，潜在的MHC-I分子从凋亡小泡到b2m-缺陷受体细胞的传递缺乏MHC-I蛋白。为验证这个想法,我们进行了
10、一次体外试验用b2m-缺陷 DCs如APCs和CD8 + 类的OT-1淋巴细胞作为应答器细胞。当缺乏MHC-I的DCs通过来自BCG-感染的巨噬细胞凋亡小泡被脉动，没有测到CD8 T细胞的抗原特异性活化。与之鲜明的对比，增加入来自BCG-OVA-感染的细胞的囊泡诱导健全的T细胞增殖，通过3H-胸腺嘧啶脱氧核苷合体作用确定。OT-1细胞通过来自BCG-OVA-感染的巨噬细胞的囊泡的刺激在缺乏b2m-缺陷DCs中未能引起CD8 T细胞的活化(图2C,底部)。因此,凋亡小泡直接影响OT-1细胞或OT-1细胞调节抗原表达可以被排除。 另外,我们还分析了凋亡小泡的关于其他T细胞种群的交联能力。我们进行了
11、在MHC-II的环境中特异性针对OVA肽的TCR-转基因CD4 T细胞采纳性的转移，用感染或未感染的巨噬细胞的囊泡免疫受体小鼠。图2D表明,来自感染细胞的凋亡小泡有效激活CD4 T细胞。总之,在体内凋亡小泡有效地交联CD8的T细胞。除了抗原呈递外,囊泡能够传递抗原呈现分子到受体APC。囊泡-诱导的T细胞的活化包括CD4T细胞启动。这条便道路径需要DCs的归巢。 因为我们观察到用凋亡小泡皮下免疫接种后位于引流淋巴节CD8 T细胞的活化,我们旨在阐明小泡在外周和淋巴组织之间的运输方式。考虑到小泡运输的两种可能或直接通过淋巴或通过媒介细胞,我们在皮下注射前通过荧光染料标记凋亡小泡，目的是为了测定它们
12、的终点。标记的一天后,我们切除引流淋巴结，制成冻干切片。在组织染色后通过抗体抗DC标志CD11c以及巨噬细胞特异性表面蛋白F4/80，我们在共焦显微镜下检测了淋巴节截面。图3显示为CD11c DCs(+)相互排斥的染色以及在淋巴结截面的巨噬细胞(F4/80 +)(上左)。皮下注射后位于淋巴节点发现红色荧光小泡的几行(图3A,底中部区)。标记的凋亡小泡的位置上叠加在DCs染色上(图3A,底部左)。DCs和小泡的覆盖层很大程度上说明了共区域化，表明凋亡小泡是通过DCs处理(图3A,底部右)。提议在外周部DCs吞没小泡，随后迁移到引流淋巴结。除了这些形态学数据,我们对于DCs的归巢做了功能性实验。我
13、们利用趋化因子受体7(CCR7)缺陷的小鼠，通过天然的和记忆性T细胞以及成熟的DCs表达作为归巢至淋巴组织的前提。我们通过来自BCG-OVA-感染的巨噬细胞的凋亡小泡免疫CCR7-缺陷动物并采纳性地在平行组中转移CFSE-标记的 OT-1细胞。转移三天后，来自淋巴结的细胞被隔离并着色为CD8。流式细胞仪等分析显示相较于在野生动物增生性反应，在CCR7 -基因敲除小鼠中缺乏CD8 T细胞的活性(图3B,上)。为排除CCR72/2固有缺陷小鼠事先指导野生型CD8 T细胞,我们通过SIINFEKL肽并联OT-1细胞转移非脉冲调制或脉冲调制野生型DCs到CCR72/2受体。采纳性转移的三天后，流式分析
14、显示适当的抗原特异性CD8 T细胞的活化(图3B,底部)。综合起来看,我们在CCR7-缺陷系统中的功能试验验证了形态学数据,表示DCs归巢是绝对需要 通过凋亡小泡的CD8 T细胞的交联。凋亡小泡在DCs中的处理因为DCs显示为CD8T细胞通过凋亡小泡交联的中心,我们进一步关注在APCs中小泡的不同处理。一个体外T细胞检验设定骨髓源性DCs作为APCs(抗原提呈细胞)与CD8 + -提纯的OT-1细胞作为应答T细胞进行共培养。通过由BCG-OVA-感染的巨噬细胞衍生的凋亡小泡脉冲DCs后，CD8 T细胞通过抗原特异性增殖进行应答并通过3H-胸苷分割OT-1 细胞合体作用作为记录。在用小泡孵化前通
15、过洛霉素DCs处理并补充T细胞以剂量依存性的方式消除CD8 T细胞反应(图4,上面)。洛霉素阻碍了核内体的H+-ATPase,便利于晚期核内体和溶酶体的酸化。因此,通过洛霉素对OT-1细胞刺激的抑制,证明凋亡小泡的核内体处理对CD8 T细胞活化的重要性。APCs与蛋白酶体抑制剂MG132的预孵化对T细胞活化(图4,上面)。为了排除表现在CD8 T细胞之间的细胞抗原呈递的影响,我们通过来自诱导T细胞的活化失败的感染的巨噬细胞的小泡脉冲OT-1细胞。为了排除使用的化学抑制剂的毒性反应,我们在用洛霉素或MG132孵化前以低(0.1毫克/毫升)或高(1毫克/毫升)浓度的SIINFEKL肽脉冲DCs并随
16、后加入CD8 T细胞。因为T细胞对肽呈递应答的损伤不能被观察到,该抑制剂的任何毒性作用可被排除(图4,上面)。在相同的试验设置中使用卵清蛋白(5毫克/毫升)显示在存在MG132中T细胞应答终止,表明蛋白酶体在 CD8 T细胞通过可溶性蛋白交联中的重要性(图4,底部)。为评估蛋白酶体和溶酶体酸化的效能，我们在抑制剂下at a moi of5通过重组表达OVA的单核细胞增多性李斯特氏菌(L.m.-OVA)感染DCs溶酶体。由于李斯特菌的作用,感染后李斯特菌能诱发膜孔逃脱吞噬小体迅速到达细胞质。这使我们得以对细胞质蛋白质的处理研究MG132的影响。图4(下部)展示了由于蛋白酶体的缺陷抗原识别的完全阻滞。自从李斯特氏菌施展在酸性环境中最优活性以来，核内体的腔隙的中和作用同样减少了T细胞的活化。最后,探讨洛霉素和MG3在MHC-II限制性抗原呈递中的影响,我们在与抑制剂孵化前用卵清蛋白(5毫克/毫升)
