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1、海水养殖鱼类细菌性疾病研究概况（海南大学 海洋学院 高炳淼）摘要：本文概述性地介绍了发生在海水养殖中的常见细菌性疾病主要症状，流行情况及病原菌特征。人们正在努力通过遗传育种筛选有抗病力的养殖品种来防治鱼类疾病的发生。虽然抗菌素由于存在抗药菌株和鱼体残留，但它仍是目前对细菌性病疾病的常规疗法。而海洋藻类提取物和中草药的使用对细菌的抑制作用已被人们所认识。它将会成为一种有潜力的抗菌药物。关键词：细菌性疾病；免疫接种；藻类提取物；中草药1. 海水养殖鱼类常见细菌病1.1 弧菌病弧菌引起的症状明显，多数种类是海水鱼养殖中的常见病原。如流行最广泛的鳗弧菌导致多种重要经济鱼类出现典型败血症，病鱼表现为体表
2、、鳍、内脏等出血，严重贫血，皮下组织水肿等；典型条件致病菌哈氏弧菌和溶藻弧菌可导致海水鱼类体表甚至肌肉溃烂，皮下出血，吻部断裂；创伤弧菌常导致鱼类头部充血发红，眼眶周边出血，眼球充血、白浊、外突，腹部膨胀等症状，有些个体还表现神经症状；河流弧菌导致病鱼体色变黑，肝脏肿大、褪色，肠壁充血，最后死亡；杀鲑弧菌常引起鲑鱼及鳕鱼类的冷水性疾病和Hitra病，其典型症状表现为贫血，盲肠、腹部脂肪、肾脏等内脏器官出血。1.2 发光杆菌病原嗜盐发光杆菌杀鱼亚种以前也称为杀鱼巴斯德氏菌，最早于1963年分离自野生美洲狼鲈，此后严重威胁日本的养殖五条，同时也引起鲈鱼及一些扁形鱼类等发病，其症状特点之一是病鱼内脏
3、尤其脾脏和肾脏均出现瘤状结节，通常1820时发病死亡。巴斯德氏菌症，也叫类结节病是一种由杀鱼巴斯德氏菌引起的细菌性疾病。该菌为革兰氏阴性杆菌，无芽孢、无动力、菌体大小因培养条件而异；有时长杆形、有时近球形、具显著的多形性。该病在五条鰤中的流行时间为 6、8 月 水温在 20-28 之间，但在鯵鱼中的暴发温度为22-23低于19时死亡率明显降低(Toshihiro 1992) 。在牙鲆中的发病温度范围为20-27 。 在牙鲆中发病初期的主要症状为体色黑化、无力游动。背鳍、腹鳍基部烂状、出血、死亡鱼体内脏肾、脾有许多小白点(水野芳嗣 1994)。楠田理一(1991)报道赤点石斑鱼仔鱼发生脾脏和肾脏
4、形成小白点的疾病。结果表明其沉降反应相与对照用的鰤鱼病原菌一致认为由杀鱼巴斯德氏菌引起。Aoki 等1985 年发现许多菌株具抗药性。Fukuda 和 Kususa 1985 Kusuda1988 对五条鰤进行了免疫接种试验研究，但仍停留在实验室阶段。 Magarinos(1996)等认为该菌的细胞附着性和入侵性主要在感染初期，该菌在机体内获得铁的机能，菌体外产物及荚膜成分是发挥病原性的主要因素。该菌感染一定时间后，由于其他细菌的生长，常规培养检测有一定的难度。Dolores 1988 用荧光抗体技术检测黑鲷仔鱼的巴斯德氏菌 不仅延长了有效检测时间，且灵敏度有大大提高。Kawhara 等 19
5、89 用该技术研究巴斯德氏菌在五条鰤组织中人分布认为不管用何种方式感染细菌在3小时侵入内脏，在脾脏和肾中形成病灶，导致败血症的发生。我国天津海区养殖的黑鲷 真鲷和鲈鱼中都有巴斯德氏菌引起的鱼病发生 1.3爱德华氏综合病爱德华氏综合病，又称腹水病。在牙鲜中的卞要症状为病鱼腹部膨胀，肛门扩张发红，常出现脱肠症状，眼球白浊化，突出，有的可见肝脏出血和肾脏肥大，一般死亡率不是很高。病鱼摄食不良，体色黑化，无力游动。引起的原因为肠内细菌缓慢爱德华氏菌感染所致，该菌为短杆菌，0.5-1 u m 1-3 u m，具运动性，革兰氏阴性。其流行无明显年龄特征，仔鱼到成鱼均有可能感染(Austin 1993) 主
6、要发生在养殖的牙鲆中。Takaji等(1993)认为该菌不产生毒素，但它对鳗鱼的补体的调理作用有一定的抗性，而日对其中性细胞也具有抵抗作用。Mamnur （1994)对养殉牙鲜的爱德华氏菌的研究认为从牙鲜中分离到的菌株和其环境中分离到的菌株共有一种热稳定的O抗原，并日认为养殉环境中引起牙鲜疾病的只有一种血清型。Suprapto(1995)认为属十血清型A的有毒爱德华氏菌株产生对日木鳗鲡和牙鲜致死的热不稳定物质，而日毒素在缓慢爱德华氏菌的毒力中起中要作用。Suprapto(1996)对该菌的进一步研究表明，有病原性的菌株的胞外产物和胞内因子都对日木鳗鲡和牙鲜有毒性，但非病原性菌株两者一都没有毒性
7、，胞外产物在培养72小时一后产生，适温是25-30，胞内因子在培养24小时一就产生。马久地隆幸(1995)用德华氏菌对牙鲜进行了不同方式的感染实验。同年他还用福尔马林灭活死菌对牙鲜进行不同方式免疫试验，结果却出现慢性死亡，据确认是由于菌体外产物和菌体成分中含有对牙鲆致死的的毒性物质。1.4 链球菌症链球菌常引起鱼类中枢神经损坏导致化脓性突眼症及脑膜炎等。可用普通培养基进行分离，在血琼脂培养基上生长加快。生化检测难以区分格氏乳球菌和乳球菌乳亚种Llactissubsplactis或鱼型链球菌和乳链球菌，因此需要适当的特异性血清进行荧光检测和玻片凝集测试以确定菌株的血清型。核糖体生物分型法、RAP
8、D和PFGE等分子生物学方法研究了鱼类链球菌病的病原差异性。就鱼型链球菌而言，利用核糖体生物分型法可区分来自美国和以色列鱼类的菌株，并显示这两个国家的鱼类链球菌病在流行病学上没有关联；在特异性PCR检测方法中，以16S rDNA扩增为基础的技术方法是诊断这些革兰氏阳性球菌的常用方法。疫苗防治方面，防治鱼类链球菌病的疫苗保护力受到鱼类、病原菌的种类及给药方式的影响，且所有的疫苗都须通过腹膜注射方式才能提供最佳保护力。这些疫苗对虹鳟提供保护时间较短，但对黄尾和大菱鲆保护时间较长。1.5 诺卡氏菌症诺卡氏菌症的主要症状为病鱼体表有点状出血斑，小而隆起的浓肿，有时口唇部糜烂。本病的典型症状是脾脏及肾脏
9、上有白色结节的病变；另一种流行症状主要发生鳃上，也叫鳃型诺卡氏菌症，可在鳃上见到直径为 5mm 的不规则结节，也有两种症状混合出现的。Kariya(1968)报道了该病是由帕卡奇诺卡氏菌引起的，主要发生在鰤鱼和鰺鱼中。该病主要在秋季流行，但七月到二月均可暴发，上述症状均有发现。1984 年发生在日本养殖牙鲆的当龄鱼中，病性发展缓慢。但是长期地连续地死亡，累积死亡率达15 %，是危害严重的疾病之一。病原菌为帕卡奇诺卡氏菌革兰氏阳性、菌体分枝丝状、无运动性。(Dolores 1986) 诺卡氏菌也是引起淡水鱼诺卡氏菌症的病原，但菌种为星状诺卡氏菌。黄琪琰 1993 Chen(1992)将从台湾大口
10、黑魲病鱼中分离的星状诺卡氏菌注射给健康的大口黑鲈，结果和自然发病鱼一样形成典型的肉芽肿，并从死鱼中再次分离到细菌，证明了该菌为大口黑鲈的病原菌。1.6 细菌性肾病鱼肾杆菌引发的是慢性系统疾病，其症状特点表现病鱼内脏尤其肾脏呈淡灰色且肿胀坏死，最后死亡，可通过垂直传播，一旦发病几乎无法治疗。可通过特异性抗血清鉴定病原鲑鱼肾杆菌，其主要公共抗原是具热稳定性的p57蛋白，这种蛋白存在于细胞表面，当鱼类受感染时鱼血清组织也会释放这种蛋白，对该疾病的诊断基础正是对这种57 kDa主要可溶性抗原的检测。鲑鱼肾杆菌是一种高度保守的基因种类，导致区分不同地区和生物来源的菌株难度更大。通过DNA指纹技术检测来自
11、美国、加拿大和欧洲不同国家的菌株，结果显示RAPD图谱与菌株的地区来源存在微弱的关联，但其流行病学仍不清楚。1.7 杀鲑气单胞菌症杀鲑气单胞菌杀鲑亚种是引起典型疖病的病原，常导致鲑鱼类及其它多种非鲑科鱼类严重的液化性坏死或深度溃疡，引发慢性或急性出血性败血症。使用常规微生物培养基可分离到该病原，但需培养48h以上才出现棕色菌落，建议使用肉汤培养基或选择性培养基CCB初步分离筛选该病原菌，从菌株的典型颜色也可简单识别该病原菌。通过DNA指纹法如RAPD分析检测到一些基因的异质性，但不能确定基因图谱与菌株的来源。很多人曾认为这种病原菌的毒性与其细胞表面蛋白的A层有关，但进一步的研究发现具毒性的菌株
12、并没有A层而无毒性的菌株却有A层，细胞表面特性虽与疖病的致病机理有关，但不是决定该病原菌毒性的因子。近年来常利用DNA探针和PCR引物对鱼类组织进行检测，这些分子生物学方法都是以质粒序列、A层或16SrDNA作为靶基因。尽管PCR直接扩增A层基因是检测杀鲑气单胞菌特异性最高的方法，但与嗜水气单胞菌Ahydrophila存在交叉反应。最新研究指出针对fstA基因设计的新引物组合对杀鲑气单胞菌所有菌株都具特异性。2 海水养殖鱼类的抗病育种养殖的海水鱼类的抗病力存在很大的差异，不同的种类，或同一种类中不同种群间，或同一种群中不同的个体对疾病的抵抗力都不同。因而通过一定的方法筛选抗病力强的个体是促进鱼
13、类养殖健康发展的最重要的方法。由于一些鱼类对某一病原具有天然抵抗力，而且这种不感染性可能具有遗传性。所以除了有选择性地养殖一些有天然抵抗力的鱼外，抗病性育种是最有效的方法。鱼类专家从60年代开始研究通过遗传改良培育抗病品种，来降低各种病原微生物对鱼类生长的威胁。对疾病抗性的主要的衡量指标是在养殖条件下的存活率。实验条件下被某一病原攻击后的存活率，鱼类的一些免疫指标及生理指标也作为相关的间接指标。因而抗病鱼类的遗传育种工作主要集中在以下两个方面：鱼类抗病能力方差分析研究及抗病育种的方法研究。从海洋生物的功能基因入手，有助于培育出优质、高产、抗逆的养殖新品种，从根本上解决海水养殖生物“质”、“量”
14、和“病”的问题，同时还有助于开发具有我国自主知识产权的海洋基因工程新药，部分解决海洋药源问题。美国启动最早， 已经筛选到一批与发育、生殖及免疫相关的功能基因；日本针对疾病和免疫相关功能基因进行重点研究；国外目前工作重点，均集中到建立功能基因分析技术平台上。 3 海水养殖鱼类细菌性疾病的防治方法3.1免疫接种促进某一养殖鱼类健康生长的重要方法是增强宿主对疾病的抵抗力，鱼类虽然是低等的脊椎动物。但已具备了有效的免疫系统：包括特异性免疫和非特异性免疫。免疫接种是提高鱼类特异性免疫的最佳方法，而使用免疫刺激剂正成为提高鱼非特异性免疫力的有效方法。1942 年 Duff 用灭活的杀鲑气单胞菌用投喂法免疫
15、鳟鱼使蹲鱼获得一定免疫力的实验揭开了鱼类免疫接种的序幕。免疫接种在目前防治鱼类细菌性疾病中发挥了较好的作用。1975年美国疫苗有限公司获准生产商品性鱼用疫苗，第一个被生产的疫苗是肠道红嘴病菌苗ERM。日本也于1988 年8月批准生产香鱼弧菌疫苗。目前国外在生产上应用的疫苗已达三十几种，主要的菌苗有 ERM 菌苗、香鱼、鳗鱼及虹蹲的弧菌苗、爱德华氏菌苗等。由于细菌比病毒容易培养，目前研究细菌疫苗的重点仍在菌苗的制备方法和给予途径对免疫效果的影响。Nordmo(1997)研究了不同攻毒方法对大西洋鲑疖病疫苗的免疫效果。Press(1996)研究疫苗的不同注射方法对大西洋疖病的疫苗的成分的保留效果。
16、Magarinod(1994)研究了用不同方法制备的杀鱼巴斯德菌苗对金鲷的防病作用。佐右浩(1992)研究了疫苗的不同给予方式对鰤鱼，溶血性链球菌症的有效性。我国对鱼用菌苗的研究主要集中在淡水鱼中，尤其在对草鱼的赤皮病、烂鳃病和肠炎的防治中发挥了很好的作用，已在全国推广。关于海水鱼用菌苗的报道不多，秦启伟(1993)报道了用创伤弧菌菌苗免疫防治青石斑鱼细菌病，在实验室内取得令人满意的结果。3.2抗菌素虽然抗菌素在防治鱼类细菌性疾病中存在诸如鱼体存有药物残留及产生抗药菌株等缺点，但在目前它仍不失为防治细菌性疾病的有效方法。自50年代氯霉素被首先引入水产业，此后几年磺胺类药物几乎成为水产业的万能药。进入70年代后，具有对革兰氏阴性菌广谱杀菌作用的哇诺酮类药物如恶喹酸、氟哌酸等获准在水产上应用。从而开创了喹诺酮类鱼药的新时代，日本渔业部门对鱼药的使用有严格的规定，并由农、林、渔业部通过立法执行。 Sano，1987 如对高体鰤弧菌病，用盐酸四环素每天
