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1、用辣根过氧化物酶追溯周围神经联系法辣根过氧化物酶(Herseradish Peroxidase)最早由Richard(1960)等人1用来研究肾近端小管的早期吸收情况，将HRP注入鼠静脉内，离隔一定时间进行观察。70年代Kristensen是将HRP用于神经系统联系的创妙人2，他的第一部分工作即是将HRP注入腓肠肌内而观察中枢（前角运动细胞）的HRP阳性标记颗粒。1972年Lavai和Lavai et al3首次将HRP用于中枢神经系统。他将HRP注入小鸡的中脑顶盖部分,30小时后取材, 观察视网膜节细胞内的HRP阳性标记细胞。1973年以后, 此法用于中枢神经系统者逐渐增多。将HRP注入周围
2、神经末梢部分, 观察其向中枢的联系, 近年来开展了各方面的探索：里见肇及山本悌司等人进行的试验：是将HRP注入胃壁包括胃体、胃底、幽门等处,观察延髓迷走背核及孤束核的内侧部的酶标颗粒, 以及将HRP注入猫心脏窦房结观察延髓迷走背核及孤束核的酶标颗粒1,5。Dalsgaard, Elfvin(6)等人将HRP注入肠系膜下节及交感颈上节, 观察脊髓内五个交感核的酶标颗粒及其节段性。至于用HRP法追踪周围神经联系的研究工作, 目前国内外开展很少。只有Lowrence7将HRP注入一侧牙髓后观察同侧三叉神经半月神经节细胞内的HRP阳性颗粒；此外他还切断坐骨神经将断端浸入HRP液内, 在后根脊神经节细胞
3、内找到HRP阳性颗粒。Elfvin还将HRP注入荷兰猪的肠系膜下节, 观察脊神经细胞内HRP阳性细胞的节段性。国内从事HRP法研究的学者也多是研究中枢神经系内各核团的联系, 而用HRP法从事周围神经系联系者则鲜见。因此我们用HRP法追溯胃交感内脏传入第一级神经元-脊神经节细胞内酶标颗粒和足三里穴区一级感觉神经元-脊神经节细胞内酶标颗粒。建立了HRP追踪围围神经联系的方法, 开展了对胃交感内脏神经元的节段性问题的探讨。对针刺足三里穴区作胃肠手术或针刺治疗胃肠疾患进行了形态学基础的研究。一、辣根过氧化物酶的注入问题注入的浓度及时间：HRP注入法在追溯中枢神经联系和周围神经联系有所不同。中枢神级系统
4、内HRP需要用蒸馏水或生理盐水配成高浓度的溶液, 但也有用pH7.4的磷酸缓冲液做溶剂者8。其浓度是30%-50%，注射量是0.05l-0.1l, 0.1l-0.25l，最大量可以是0.5l。住射速度很慢, 一般约为0.1l/10分。Nauta认为可慢至0.05l/h, 注射后留针15-30分钟。HRP法在周围神经联系方面, 所用的HRP配制法与中枢相同, 是用蒸馏水或生理盐水配制, 但浓度较低, 1%、5%、10%, Yamamato及Teiji在猫胃壁注入时所用浓度为20%-30%, 注入时间没有说明。而在心脏窦房结及房室注入HRP时浓度为30%-50%。Elfvin在荷兰猪的肠系膜下神经
5、节内注入的浓度25%-30%在5-10min内注入完华。我们的实验, 是用8-10mgHRP溶于80-100l的蒸馏水, 浓度是10%注入猫、兔胃壁内, 注入速度是1l/min, 所得的结果是比较满意的, 经过灌流及孵育等过程, 脊神经节细胞内的HRP酶标颗粒在光学显微镜明视野下, 细胞质内核的周围呈棕黑色颗粒, 暗视野下观察此棕黑色颗粒则成明亮的小点（参看本期胃交感内脏传入神经元的节段性一文附图。以同样的浓度浸胞足三里穴区的腓深神经断端, 也可以在脊神经节细胞内得到同样的结果。二、HRP注入后动物的存活时间问题关于HRP的运输问题, 一般认为是通过神经细胞体与突起末梢间存在着的双向流动的轴浆
6、流axoplasmic flow来运送的。无沦是树突还是轴突都有这种现象9。注射部位的HRP被神经末梢及神经终末部分无髓段细轴突以胞饮方式吸收。在周围神经注射后存活时间：日本学者里见肇、山本悌司在胃壁注入HRP后2-3天在迷走背核及孤束核的细胞内有酶标颗粒,Law， Furst将HRP注入大鼠牙髓腔后1-2天在三叉神经半月神经节内看到标记细胞：Elfvin，将HRP注入肠系膜下节, 术后24-48h在脊神经节细胞内看到酶标颗粒。Dalsgaard10将HRP注入豚鼠肠系膜下节及交感颈上节后,48小时后在脊髓五个交感核内看到酶标颗粒。根据我们实验室的经验, 较大动物如兔和猫存活的时间应当长, 将
7、HRP注入胃壁, 存活4-5天脊神经节细胞内酶标颗粒非常清晰。甚至存活7天的动物仍可见到脊神经节细胞及纤维内有酶标颗粒的出现。因此我们认为用HRP追溯周围神经联系时, 较大动物（猫、兔）存活时间适当长些。三、固定液的问题用HRP法显示神经细胞内标记颗粒, 无论是中枢或周围部分, 固定液的选择是个重要的关键, 在文献中多采用多聚甲醛、戊二醛混合液。戊二醛能较好的固定组织超微结构, 多用于电子显微镜技术, 虽然对酶有一定的破坏作用, 但仍然有相当程度的酶活性可以保存下来。其缺点是穿透能力太小, 对大的组织块固定, 多在固定液中加入穿透力强的多聚甲醛来补其不足。多聚甲醛为甲醛聚合物, 不溶于水, 但
8、加水煮沸则可以解聚成甲醛单体而溶解, 因此用多聚甲醛灌流时须煮沸之。甲醛对酶的破坏作用比戊二醛小, 但在室温下仍可破坏HRP的活性, 所以Straus（64年） 11认为多聚甲醛灌流液应在0-4 时, 对动物进行灌流, 可保持HRP的活性。多聚甲醛及戊二醛的浓度问题在文献中各不相同。用HRP法探索中枢神经的联系时, 文献报导多聚甲醛的浓度为0.4-2.5不等。至于所用的缓冲剂皆为磷酸盐缓冲液, 因为多聚甲醛在弱碱性环境下对组织固定较好, 所以pH值多在7.2-7.4之间。在周围神经系统用HRP法显示酶标记时Elfvin和Daisgaard（77年） 等人只用3-5%的戊二醛溶于0.1M Cac
9、odylate(卡钻的纳)缓冲剂内进行灌流, 可得到较好的结果。Lewreoe Furst（75年）用1%多聚甲醛加入1%的戊二醛溶于0.1M Cacodylate缓冲剂内（pH为7.5）进行灌流, 效果也甚好。日本的里见肇及山本悌司在胃浆膜下注入HRP观察延髓迷走背核及孤束核的HRP标记颗粒时则用2%多聚甲醛及0.5%的戊二醛作为固定液。我们实验室将里见肇的方法加以改良, 单独用2%多聚甲醛, 不加戊二醛, 溶于0.1M磷酸盐缓冲剂内pH为7.2-7.3, 在灌流动物时用冰将固定液冷却至0-4 进行灌流得到满意的结果。对于是否加戊二醛的问题, 我们认为戊二醛和多聚甲醛都可以做为固定剂, 戊二
10、醛对酶的破坏性比多聚甲醛大, 而其穿透性又比多聚甲醛要小, 所以可以不用戊二醛（此药比较贵重, 而且不易买到）。灌流液冷却至0-4 , 这不仅是防止酶的破坏, 另一方面还可以减少酶的扩散12。灌流后取材, 再将组织浸泡于同一固定液1-2小时, 然后用含5%的蔗糖0.1M的磷酸盐缓冲液（pH7.2-7.3）中冲洗, 洗三次（每次隔20分钟）后置冰箱内过夜, 第二天早晨切片并做成色反应。取材后固定时间要视组织块的大小而定, 从一小时到几小时不等。如组织块小固定时间长, 则可抑制酶的活性而影响成色反应。加入蔗糖的目的是保护渗透压（13）固定不良则酶易受渗透压的影响而在制片过程中HRP被扩散, 加入蔗
11、糖的百分比, 一般认为5%-10%。四、成色反应及辨别问题辣根过氧化物酶的成色反应, 最初是Straus联苯胺作为成色剂。在低温或弱酸环境下呈兰色, 而在室温及弱碱情况下呈棕色。1966年Graham用3-3二氨基联苯胺（Diomino banzemdine tetrahydrcchlo）简称DAB做成色剂是棕色反应。成色反应可在DAB（或联苯胺） 加H2O2液中一次完成, 也可以分为二步。将切片置于DAB（或联苯胺） 加H2O2液中进行孵育是一次成色反应。如将切片先放入DAB液中置37 恒温箱内浸泡一定时间, 然后加入H2O2再浸泡一定时间为二步完成成色反应。根据我们实验室的经验还是分两步较
12、好。我们先将切片置于0.05%DAB液中（溶剂为含5%蔗糖的0.1MPO4缓冲液, pH7.2-7.3）在37 恒温箱中进行予染30分钟, 然后再将予染液连同切片从37 恒温箱中取出加入0.3%H2O2（每毫升染液中加入1毫升） 置于室温（20） 内30分钟进行孵育。如上述步骤HRP在神经细胞内的棕色颗粒清晰可见, 围绕着细胞核的周围成为比较均匀的棕黑色颗粒。暗视野现察, 棕黑色的颗粒呈明亮的小点与黑色的背地形成显明的对比, 恰似夏夜星空一样瑰丽。此外, 我们的试验证明:HRP在孵育液内时间过长或温度过高则神经细胞质内呈现均匀的黄色背地。以致影响HRP棕色颗粒的清晰度, 对显微摄影及镜下观察都
13、有一定影响。五、用HRP法追溯周围神经联系的可靠性问题HRP法用于中枢神经系统自从Lavail et al在1972-1973年开始建立以来, 近七、八年间, 这方面的实验工作如雨后春笋, 有许多报导。对于其可靠性问题似无非议。因为在中枢有血脑屏障, 辣根过氧化物酶（分子量）40000不能从血液进入脑组织。关于周围神经系统HRP是否可以由神经末梢摄入, 经轴浆流入神经细胞体而不是血液运输至神经细胞内的问题。根据我们的大量试验（兔60只, 猫30只）结果, 是可以肯定的。（参见本期胃交感内脏传入神经元的节段性一文）。从50年代Nauta溃变神经染色法问世以来, 神经解剖学向前推进了一步, 解决了
14、许多没有解决的问题。70年代HRP法的建立, 更使神经解剖学的进程大大向前推进。我们目前的实验工作, 可用HRP法分别观察交感内脏传入一级神经元脊神经节细胞的节段性和体壁（足三里穴区）一级感觉神经元脊神经节细胞的节段性。如无HRP法的建立是无法进行这种实验的。因此HRP法对追溯周围神经系统的联系起到了巨大的作用；对探讨神经解剖学中尚未解决的问题是个好的研究方法。同时, 对针灸针麻原理中经络实质的研究-体表内脏相关的问题也起到推动作用。洪伟杰张朝晖芦国营.辣根过氧化物酶的结构与作用机制2. HRP的作用机制2. 1植物体内的功能由HRP催化的多数反应可由以下等式表示,AH +H2O2-A + 2
15、H2O其中AH是还原性底物, A是自由基。还原性底物包括芳香族化合物,酚类化合物,吲哚,胺类和磺酸盐。在HRP催化反应中,自由基的形成暗示了HRP在植物胞内中可能所起的作用。这些功能可能包括一些交联反应,如: 酪氨酸交联形成双酪氨酸,交联酚类单体形成软木脂,氧化偶合酚类化合物等。当遇到一些外部因素时,过氧化物酶的交联反应就有可能启动,如: 植物组织受到创伤。当失水或有病原体入侵时,此类植物就会合成一种保护性的聚合物屏障来减少伤害, 如: 软木脂等。但是HRP在体内的作用并没有完全被阐明 8 。2. 2 催化机制Dunford 等 9 广泛地研究了HRP的催化机制,尤其是HRP C。图3中以阿魏
16、酸( ferulate)为还原性底物,阐述了一些催化循环中的重要特点。图3中生成的两个带电子的产物可能会引起更复杂的反应,包括形成二倍体、三倍体、多聚体,以及启动一个以该产物为底物的反应。催化循环的第一步是H2O2 和静态酶中的Fe( )反应生成化合物 (HRP) , HRP是一个高氧化态的催化中间体,包含一个含氧Fe ( )中心和一个带正电荷的卟啉。其实低温下在HRP形成的过程中还测到另一个催化中间体(HRP0) , HRP0被看成是H2O2-Fe ( )混合物,但是它的存在非常短暂。在正常情况下, HRP再经过两个等式就能回到静态酶。第一个等式由一分子还原性底物的加入,生成另一个含有含氧Fe ( )中心的催化中间体HRP。HRP和HRP都是强氧化剂,氧化还原电势接近+ 1 V。第二个等式也是有一分子还原性底物参加,使HRP
