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1、第三章 灭菌与空气净化第一节 灭菌一、 发酵工业灭菌的方法二、 湿热灭菌的原理三、 培养基灭菌温度的选择四、 培养基与设备、管道灭菌条件第二节 空气净化一、 空气净化的方法二、 空气净化的流程三、 空气过滤除菌的原理和介质自从发酵技术应用纯种培养后，要求发酵全过程只能有生产菌，不允许其他任何微生物共存，因此所有发酵过程必须进行纯种培养。杂菌一旦侵入生产系统，就会在短期内与生产菌争夺养料，一方面消耗营养基质，另一方面分泌一些有毒产物，这些物质是一些会抑制生产菌生长、改变培养液性质、抑制产物合成或破坏代谢产物的有毒副作用的物质，如发生噬菌体污染，生产菌细胞将被裂解，轻则影响产量，重则导致生产彻底失
2、败，造成严重经济损失，因此，整个发酵过程必须树立无菌观念。为了确保纯种培养，在生产菌接种前，要对培养基通入的空气、各种添加物、设备、管道等进行灭菌，还要对生产环境进行消毒。因此，掌握消毒和灭菌技术在发酵中具有非常重要的意义。第一节 灭菌(sterilization)一、 发酵工业灭菌的方法灭菌：指利用物理或化学的方法杀灭或去除物料及设备中所有的生命物质（包括营养细胞、细菌芽孢和孢子）的技术或工艺过程。消毒：是利用物理或化学的方法杀死物料、容器、器具内外及环境中的病源微生物的技术或工艺过程，一般只能杀死营养细胞而不能杀死芽孢。消毒不一定能达到灭菌要求，灭菌则可达到消毒的目的。发酵工业生产中常用的
3、灭菌方法有下列几种，根据灭菌对象和要求选用不同方法。1、 干热灭菌法（1）原理：干热灭菌法是指利用干燥高温的热空气使微生物细胞内各种与温度有关的氧化反应速度迅速增加，从而使微生物的致死率迅速增加的过程。高温对微生物有氧化、蛋白质变性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。（2）常用方法：灼烧和电热箱加热。灼烧是最简单的干热灭菌的方法，是将金属或其他耐热材料制成的器物在火焰上灼烧，如接种针、三角瓶口等的灭菌。大多数的干热灭菌是利用设备如电热鼓风干燥箱加热到一定温度将微生物杀死。干热灭菌所需的温度较高，时间较长，一般160170，1h1.5h。（3）适用范围：主要用于灭菌后要求保持干燥的物料、器具等的灭菌如
4、：玻璃及金属用具及沙土管灭菌-三角瓶口、试管口、培养皿、接种针、固定化细胞用的载体材料等（4）优缺点：干热灭菌方法简单，灭菌后物料可保持干燥状态，但灭菌效果不如湿热灭菌。2、 湿热灭菌法（1）湿热灭菌法是指利用加压的饱和蒸汽对物料或设备容器进行灭菌的方法。原理：蒸汽穿透能力强，且在冷凝时放出大量的冷凝热，高温有水的条件很容易使蛋白质发生不可逆的凝固变性，使微生物在短时间内死亡，达到灭菌的目的。（有水分条件蒸汽冷凝形成的下，微生物细胞中的蛋白质变性温度会显著降低）（2） 常用方法： 饱和蒸汽灭菌：一般121，30分钟（3）湿热灭菌具有蒸汽来源容易、潜热大、穿透力强的特点，与其他灭菌方法相比具有灭
5、菌效果好、操作费用低的优点，被广泛应用于工业生产，如生产设备、培养基、管道、阀门、流加物料等灭菌，是目前最基本的灭菌方法。3、 射线灭菌法（1）利用紫外线、高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭微生物紫外线、高能电磁辐射、放射性物质产生的高能粒子可以穿透微生物细胞，与菌体核酸发生光化学反应，造成菌体死亡，达到灭菌的目的（2）常用：紫外线、X射线、射线由Co60产生、高速电子流的阴极射线等。最常用的是紫外线，波长在250nm270nm之间灭菌效率高，以260nm左右效率最高。（3） 使用范围：使用方便，但与湿热灭菌相比穿透力差，适用范围有限，一般只用于无菌室、无菌箱、培养间等局部空间灭菌和器皿表面灭菌
6、。 4、 化学药品灭菌法（1）许多化学药剂能与微生物细胞物质发生反应而具有杀菌作用。如75%酒精溶液、甲醛、苯酚、高锰酸钾、漂白粉、环氧乙烷、季铵盐（如新洁尔灭）等。0.1%0.25%高锰酸钾溶液、5%有效氯浓度的漂白粉溶液、37%左右的甲醛溶液0.25%的新洁尔灭和杜灭芬溶液。化学药剂能与微生物中的某些成分发生反应，从而使微生物氧化变性或发生细胞损伤。（2）使用范围：因化学药剂也会与培养基中的一些营养物质产生作用，而且加入培养基中后不易去除，遗留毒性及腐蚀性大，所以化学药剂灭菌不用于培养基灭菌，只用于实验室、无菌室的空间灭菌或某些器具器械的灭菌如溶氧电极、双手等表面消毒。5、 过滤除菌法（1
7、）过滤除菌法是一种利用过滤方法阻留微生物以达到灭菌目的的方法。原理：利用微生物不能透过滤膜除菌。0.010.45 mm孔径滤膜。（2）使用范围：用于压缩空气、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。对于对热敏感的物质，这是一种有效的方法。工业上常用过滤法大量制备无菌空气，供好氧微生物培养使用。在产品的提取中，也可用过滤的方法（如超滤）处理料液，以得到无菌产品。湿热灭菌法是是目前最基本的灭菌方法，看一下湿热灭菌的原理：二、 湿热灭菌的原理-灭菌动力学（一） 微生物的热阻 先掌握几个概念：1、致死温度：每一种微生物都有一定的生长温度范围，且有一个最适温度范围，如大多数微生物的温度范围为550，但最适温度
8、为2537。当微生物处在最低温度以下，代谢作用几乎停止而处于休眠状态；当温度超过最高温度限度时，微生物就会死亡，杀死微生物的极限温度称为致死温度。2、致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称致死时间。在致死温度以上，温度越高致死时间越短。3、微生物对热的抵抗力用热阻表示。热阻：是指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。不同种类的微生物的热阻不同，一般无芽孢细菌在60下经过10min即可全部杀死，而芽孢细菌的芽孢能经受较高温度，在100下要数分钟至数小时此能杀死。某些嗜热菌能在120下耐受20min30min，但这种菌在培养基中极少出现。一般来讲，灭菌的彻底与否以能
9、否杀死芽孢细菌为标准。（二） 微生物的热死规律对数残留定律微生物热死是指微生物受热失活直到死亡，但物理性质不变。对数残留定律是指在灭菌过程中，微生物在高温的环境中，其减小速率（即单位时间内菌体的减少量，用 表示）与任何一瞬间残留的活菌数成正比。用数学公式表示： 3-1N：残留的活菌体个数（个） t ：灭菌时间（min） K：反应速度常数（min-1）也称比死亡率，与灭菌温度及菌种特性有关。将上式移项后两边积分得：从0t，N0Nt，积分上式得 ： 。 3-2式中 N0开始灭菌时原活菌数，个； Nt 经t时间灭菌后残留菌数，个。由3-2可以知道：a) 灭菌时间取决于污染程度N0、灭菌程度Nt和K值
10、b) 培养基中的各种微生物不可能逐一加以考虑，如果将全部微生物作为耐热的细菌芽孢来考虑，就得延长加热时间和提高灭菌温度，因此，一般只考虑芽孢细菌和细菌的芽孢之和作为计算依据较合理。另外，如果要求达到彻底灭菌，即Nt =0，则所需灭菌时间t，这在实际生产中不可行。在实际设计时常采用Nt =0.001，即在1000批次灭菌中有一次失败。c) 反应速率常数K是微生物耐热性的一种特征，它随微生物种类和灭菌温度而异。相同温度下，K值越小则微生物越耐热。d) 同一种微生物在不同灭菌温度下，K值不同。灭菌温度越低，K值越小；灭菌温度越高，K值越大。如硬脂嗜热芽孢杆菌FS1518在104时K值为0.0324m
11、in-1，121时K值为0.77min-1，131时K值为15min-1，当N0、Nt相同时，硬脂嗜热芽孢杆菌FS1518在131下的灭菌时间仅为104下的灭菌时间的1/44，因此，提高灭菌温度，K值增大，灭菌时间显著缩短。三、 培养基的灭菌1、 培养基灭菌温度的选择阿仑尼乌斯（Arrhenius）方程用湿热灭菌法对培养基灭菌时，除微生物被杀死外，还伴随着培养基营养成分被破坏。实验结果证明，在高压加热条件下，氨基酸及维生素等极易被破坏，因此，选择一种既能达到灭菌要求，又能使培养基营养成分破坏最小的灭菌工艺条件，是研究培养基灭菌的重要内容。前边提到：反应速度常数K也称比死亡率，与灭菌温度及菌种特
12、性有关。随着温度的变化，比死亡速率K的值变化很大。温度对K值的影响，遵循阿仑尼乌斯定律该公式能较准确地说明温度与反应速率之间的定量关系，即： K A e -E/RT 3-3A比例常数阿仑尼乌斯常数（min-1）；E反应所需的活化能杀死细菌芽孢的活化能（Jmol-1）；R气体常数（8.314 Jmol-1K-1）；T绝对温度热力学温度（K）； e 2.71 也可表示为 lgK = _ -E + lgA （对数形式） 3-4 2.303RT lgK2/K1 = E . (T2T1) ( 定积分形式) 2.303R T1.T2以lgK对1/T作图得一直线，以1/T为横坐标，以lgK为纵坐标， 斜率为
13、-E/2.303R，截距为A，如图，从斜率和截距可求得A和E值。由3-4可知，E/R为微生物受热死亡时对温度敏感性的度量，此值越大，表明微生物死亡速率随时间的变化越敏感；反之，就越不敏感，因此，在灭菌操作中，E/R是一个十分重要的参数。实验测得，一般杀死微生物营养细胞的E值为200kJ mol-1270kJmol-1，杀死芽孢的E值为400 kJmol-1以上，酶类和维生素等营养成分分解的E值约为80kJmol-1。由于杂菌死亡属于一级动力学反应，大部分培养基营养成分的破坏为一级分解反应。在灭菌时，当温度由T1升到T2，灭菌速率常数K和培养基成分破坏速率常数K都发生变化。灭菌速率常数K值在T1
14、、T2时分别为将两式相除并取对数得：同样，灭菌时培养基营养成分的破坏也可得类似关系：将上边两式相除得：由于杀死细菌芽孢的活化能E大于营养成分破坏的活化能E，因此 ，即随温度升高，灭菌速率常数增加的倍数大于营养成分破坏速率常数增加的倍数，也就是说温度升高，杂菌死亡速率大于培养基成分破坏的速率。达到相同的灭菌效果，提高灭菌温度可明显缩短灭菌时间，并减少培养基营养成分的破坏，这就是通常说的“高温短时灭菌法”。如将芽孢杆菌和维生素B2放在一起灭菌，当温度维持118加热15min，可杀死99.99%的细菌芽孢，维生素B2破坏率为10%；而在120时加热1.5min，细菌芽孢死亡率仍为99.99%，而维生素B2破坏率为5%。2、培养基的灭菌方法（1）分批灭菌(batch sterilization) 分批灭菌也称实消、实罐灭菌、间歇灭菌。培养基的分批灭菌是指将配制好的培养基输入发酵罐内直接通入蒸汽，使培养基和设备同时灭菌的一种灭菌方式。 实消灭菌是在P26图3-2实罐灭菌设备中进行的，其操作过程主要是：实消时先将配好的培养基从配料池输入发酵罐中，搅拌打散团块，然后密闭，打开各种排气阀，通入高压蒸汽加热。为了缩短升温
